,,,,,,,*

(1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室,昆明 650500；2.青海省食品藥品檢驗所,西寧 810016)

反相高效液相色譜法測定東方草莓中兒茶素的含量

李蓉1,劉海青2,楊春濤1,江志勇1,郭俊明1,駱桂法2,黃相中1,*

(1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室,昆明 650500；2.青海省食品藥品檢驗所,西寧 810016)

建立東方草莓中(+)-兒茶素的含量測定方法。采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm)分離；以乙腈-0.1%磷酸水為流動相進行梯度洗脫,流速為1mL/min,檢測波長為280nm,對10批東方草莓中的(+)-兒茶素進行了含量測定。結(jié)果表明:(+)-兒茶素的保留時間為14.543min,其線性范圍為0.0512～0.6400μg(R2=0.9999)；加樣回收率為99.70%(RSD 2.67%)。所建方法操作簡單,穩(wěn)定可靠,可用于東方草莓的質(zhì)量評價。

東方草莓,(+)-兒茶素,反相高效液相色潽法,含量測定,質(zhì)量控制

東方草莓FragariaorientalisLozinsk.為薔薇科(Rosaceae)草莓屬植物,俗稱野草莓,為藥食同源性藥材。在我國主要分布于青海、甘肅、四川、陜西、山西以及東北、華中各省,朝鮮、蒙古及蘇聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布[1]。東方草莓藏藥名為“志達(dá)薩增”,干燥全草入藥,常用于血熱性化濃癥,肺胃瘀血,黃水病膿瘍[2],為藏藥經(jīng)典驗方“七十味珍珠丸(然鈉桑培)”[3]、“二十五味珍珠丸”[4]、“骨質(zhì)增生乙組合(壓迫神經(jīng)引起疼痛)”、“八味秦皮丸”[5]等的重要成分。

長久以來,東方草莓作為藏藥中的常用重要品種,缺少統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)衡定其質(zhì)量,為保證其用藥安全與藥效,本課題組對東方草莓的質(zhì)量進行了深入研究。目前尚未見有關(guān)東方草莓化學(xué)成分的具體報道。本課題組對其進行化學(xué)成分研究,經(jīng)分離、鑒定發(fā)現(xiàn)(+)-兒茶素為東方草莓中的一主要化學(xué)成分。(+)-兒茶素具有抗病毒、抗癌、降血糖、抗菌、清除自由基等作用[6-10]。因此,可將(+)-兒茶素作為東方草莓中的特征性成分。

近年來,已有文獻(xiàn)報道用高效液相法測定綠茶、杜仲、苦楝皮中兒茶素的含量[11-15],但目前未見有關(guān)東方草莓中兒茶素含量測定的相關(guān)報道。本實驗用高效液相色譜法建立了東方草莓中(+)-兒茶素的含量測定方法,為東方草莓的質(zhì)量控制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

(+)-兒茶素對照品 中國藥品生物制品鑒定所提供,批號為11877-201203,純度為97.20%；藥材 本實驗中使用了7個產(chǎn)地的10批藥材,見表1；乙腈、甲醇 色譜純；磷酸 分析純；水 超純水。

表1 10批不同來源的東方草莓藥材Table 1 F. orientalis Lozinsk from 10 different sources

Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm) 安捷倫科技有限公司；DIONEX ULtiMate 3000高效液相色譜儀 戴安公司；Waters XTerra? RP18色譜柱(5μm,3.9×150mm) Waters公司；S105DU電子分析天平、AR224CN電子天平 瑞士梅特勒公司；AS20500A數(shù)控超聲波清洗器 云南科儀玻有限公司；JP-150A-8高速多功能粉粹機 永康市久品工貿(mào)有限公司；DW100.P實驗室超純水機 上海和泰儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取(+)-兒茶素對照品1.28mg,置于50mL容量瓶中,加甲醇-水(1∶1)超聲溶解,定容,搖勻,過0.45μm的濾膜,即得 0.0256mg/mL的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 經(jīng)優(yōu)選后的供試品溶液制備方法:取本品粉末0.30g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇-水(1∶1)10mL,密塞后稱定此時具塞錐形瓶重量,放置1h,超聲處理20min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇-水(1∶1)溶液補足減失的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液過0.45μm的濾膜,即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm),柱溫:35℃；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～6min,6% A；6～20min,6%～8% A；20～ 25min,8%～10% A)；檢測波長280nm；流速1.0mL/min。

1.2.4 加樣回收率測定樣品的制備 精密稱得(+)-兒茶素對照品2.45mg,置10mL容量瓶中,加甲醇-水(1∶1)溶液適量,超聲溶解并稀釋至刻線,搖勻即得對照品溶液(濃度為0.2450mg/mL)。取已知含量的東方草莓樣品(8號)6份,每份0.30g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇-水(1∶1)溶液9mL、濃度為0.2450mg/mL的對照品溶液1mL,共10mL溶液,密塞后稱定此時具塞錐形瓶重量,按照1.2.2方法制備供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1提取工藝的確定

對提取溶劑的考察時,考慮到東方草莓中鞣質(zhì)豐富,在文獻(xiàn)[11-13,15-19]的基礎(chǔ)上,本實驗不僅用水、乙醇-水(1∶1)、甲醇-水(1∶1)、乙醇和甲醇作為提取溶劑,還用了丙酮和乙醚,結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙酮和乙醚在回流和超聲條件下幾乎不能將東方草莓中的(+)-兒茶素溶出,乙醇-水(1∶1)和甲醇-水(1∶1)對(+)-兒茶素的提取效率較好且相當(dāng),從節(jié)省經(jīng)濟考慮,選擇甲醇-水(1∶1)為最佳提取溶劑?？疾炝顺暫突亓?種提取方法,結(jié)果表明兩者的差別不大。由于兒茶素有4個同分異構(gòu)體,長時間受熱易發(fā)生差向立體異構(gòu)化反應(yīng),轉(zhuǎn)變?yōu)槠渫之悩?gòu)體[20],因此,本實驗用室溫超聲提取,以避免加熱對樣品測定的影響。對藥材的浸泡時間和超聲時間進行了考察,結(jié)果表明,藥材用甲醇-水(1∶1)浸泡60min后室溫超聲提取20min,(+)-兒茶素的提取率較高。實驗結(jié)果詳見表2。

表2 東方草莓中(+)-兒茶素的提取工藝Table 2 Extraction process of(+)-catechin in F. orientalis Lozinsk

2.2色譜條件的選擇

2.2.1 波長的選擇 兒茶素類化合物屬典型的黃烷醇類化合物[10],具有兩個吸收帶,即E2帶和B帶,分別在210nm左右和270～280nm處[21]。本實驗曾采用雙波長(210nm和280nm)檢測,但由于210nm作為檢測波長時基線漂移嚴(yán)重,所以選用280nm單波長檢測。

2.2.2 流動相的選擇 參考文獻(xiàn)[11-14,19],本實驗曾采用甲醇-0.1%磷酸水(10∶90)、乙腈-0.1%磷酸水(8∶92)等度洗脫,從供試品的分離情況和出峰時間等綜合分析,最后選擇以乙腈-0.1%磷酸水按1.2.3項下優(yōu)選的色譜條件可保證分離度并避免干擾。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取以上對照品溶液2、10、15、20、25μL進樣,按照1.2.3項下的色譜條件進行分析。以對照品的進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X),對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進行回歸處理,得回歸方程:Y=510.23X-1.0499(R2=0.9999),線性范圍為0.0512～0.6400μg。(見圖1)

圖1 (+)-兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of(+)-catechin

2.4方法學(xué)考察

2.4.1 耐用性考察 選擇不同型號的高效液相色譜儀(DIONEX ULtiMate 3000)、不同型號的色譜柱依照1.2.3項下優(yōu)選的色譜條件進行耐用性實驗。理論塔板數(shù)以(+)-兒茶素峰計算不低于8000,此時指標(biāo)成分能與其他相鄰峰分離,分離度>1.5。此時,對照品和供試品液相圖譜見圖2。

表3 精密度實驗Table 3 Precision of the measured results

表4 重現(xiàn)性實驗Table 4 Reproducibility of the measured results

表5 回收率實驗Table 5 Recoveries of the measured results

圖2 對照品溶液(A)及供試品溶液(B)的HPLC圖Fig. 2 The HPLC chromatogran of the standard solution(A)and the sample solution(B)

2.4.2 精密度考察 吸取2.1下的對照品溶液(濃度為0.0256 mg/mL),按照1.2.3項下優(yōu)選的色譜條件測定,連續(xù)進樣5次,每次10μL,分別記錄峰面積。RSD為0.30%,表明系統(tǒng)的精密度良好。結(jié)果見表3。

2.4.3 重現(xiàn)性考察 取8號來源的東方草莓6份,按1.2.2項下優(yōu)選的提取工藝制備供試品溶液,分別依照1.2.3項下優(yōu)選的色譜條件測定,進樣量為10μL,計算藥材中兒茶素含量。平均值為0.0493mg/mL,RSD為2.89%。結(jié)果見表4。

2.4.4 回收率的測定 取1.2.4項下供試品溶液依1.2.3項下優(yōu)選的色譜條件分別測定,進樣量為5μL,平均回收率為99.70%,RSD為2.67%。結(jié)果見表5。

2.4.5 穩(wěn)定性實驗 分別吸取同一供試品溶液,依照1.2.3項下優(yōu)選的色譜條件,在0、2、5、8、12、15、20、24、38、45、50、65h進樣10μL,測定檢定成分峰面積。結(jié)果表明,供試品溶液8h內(nèi)RSD為0.27%,12h內(nèi)RSD為1.25%,24h內(nèi)RSD為1.37%,65h內(nèi)RSD為1.38%,供試品溶液在65h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表6。

2.5樣品的含量測定

取7個產(chǎn)地的10批藥材粉末,每個樣品平行2份,按照1.2.2優(yōu)選的提取工藝制備供試品溶液,依1.2.3項下優(yōu)選的色譜條件分別測定,進樣量為5～30μL,測定結(jié)果見表7。

表6 穩(wěn)定性實驗Table 6 Experiment results of the sample stability

表7 10批不同來源的東方草莓藥材中(+)-兒茶素的含量Table 7 Content of(+)-catechin in F. orientalis Lozinsk. from 10 different sources

3 結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜法測定了東方草莓中(+)-兒茶素含量,分別考察了不同提取溶劑、提取方法及提取時間對東方草莓中(+)-兒茶素提取率的影響,得出東方草莓中(+)-兒茶素提取工藝(詳見1.2.2項方法),并建立了色譜分析條件(詳見1.2.3項方法)。該方法操作簡單易行,精密度高,重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好,回收率為99.70%,可用于東方草莓中(+)-兒茶素含量測定。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[18],兒茶素類化合物在加熱條件下不穩(wěn)定。為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,本實驗所使用的對照品溶液現(xiàn)配現(xiàn)用(如果不能在當(dāng)天完成分析測試,需將對照品溶液置于低溫冰箱中保存,時間為2～3d)。通過對供試品溶液的穩(wěn)定性考察,結(jié)果表明供試品溶液可在低溫下存放2～2.5d；由于供試品的制備方法簡便,測定周期短,建議現(xiàn)配制現(xiàn)用。

從表6的測定結(jié)果說明,蛇莓中的(+)-兒茶素含量明顯高于東方草莓；不同產(chǎn)地的藥材中(+)-兒茶素含量有差別,西藏地區(qū)>青海地區(qū)>成都地區(qū)?？梢?(+)-兒茶素的含量與東方草莓生長的地理特征有著直接關(guān)系,并且海拔越高東方草莓中的(+)-兒茶素含量越高。

[1]吳征鎰主編.中國植物志(37卷)[M].北京:科學(xué)出版社,2004:235.

[2]賈敏如,李星煒.中國民族藥志要[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:281.

[3]加永澤培,杜元灝.藏藥七十味珍珠丸對大鼠腦缺血梗塞面積的影響[J].西藏醫(yī)藥雜志.2012,33(3):56-57.

[4]王智森,趙獻(xiàn)超,王凱梅,等.二十五味珍珠丸治療腦出血后遺癥臨床療效觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合研究,2013,8,5(4):172-175.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].藏藥第一冊.1995:241.

[6]孫文基,繩金房.天然活性成分簡明手冊[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1998:109.

[7]曾亮,黃建安,李赤翎,等.兒茶素的抑菌效果及機理研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(5):89-92.

[8]Jankun J,Selman S H,Swiercz R,etal. Why drinking green tea could prevent cancer[J]. Nature,1997,387(5):561-561.

[9]Sakanaka S,Aizawa M,Kim M,etal. Inhibitory effects of green tea polyphenols on growth and cellular adherence of an oral bacterium,Porphyromonas gingvalis[J]. Biosci Biotechnol Biochem.,1996,60(5):745-749.

[10]劉超,陳若蕓.兒茶素及其類似物的化學(xué)和生物活性研究進展[J].中國中藥雜志,2004,29(10):1017-1021.

[11]Tetsuhisa G,Yuko Y,Masaaki K,etal. Simultaneous analysis of individual catechins and caffeine in green tea[J]. Journal of Chromatography A,1996,749:295-299.

[12]Henning S M,Claudia F L,Lee H W,etal. Catechin content of 18 teas and a green tea extract supplement correlates with the antioxidant capacity[J]. Nutrition and Cancer,2003,45(2):226-235.

[13]Chen Q S,Zhao J W,Chaitep S,etal. Simultaneous analysis of main catechins contents in green tea(Camellia sinensis(L.))by Fourier transform near infrared reflectance(FT-NIR)spectroscopy[J]. Food Chemistry,2009,113:1272-1277.

[14]曹丹,楊莉,侴桂新,等.苦楝皮中兒茶素的含量測定研究[J].中國藥學(xué)雜志,2010,45(17):1035-1037.

[15]賈智若,李兵,李耀華,等.反相高效液相色譜法測定杜仲中兒茶素的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(5):117-119.

[16]夏晶,夏斌峰,季申. 反相高效液相色譜法測定拳參中兒茶素的含量[J].中國中藥雜志,2007,32(11):1103-1104.

[17]王麗娟,張鳳有.HPLC法測定蒙成藥亞順-12中的兒茶素的含量[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2012,6:53-54.

[18]王鋼力,于健東,田金改,等.兒茶藥材化學(xué)成分分析——反相高效液相色譜法測定兒茶中的兒茶素和表兒茶素的含量[J].藥物分析雜志,1999,19(2):88-90.

[19]潘金火,嚴(yán)國俊,盧歡.反相HPLC測定金蕎麥藥材和飲片中表兒茶素的含量.中國藥學(xué)雜志,2010,45(14):1093-1096.

[20]陸蘊如主編.中藥化學(xué)[M].北京:學(xué)苑出版社,1997:135-136.

[21]戴軍,王洪新,陳尚衛(wèi),等.茶葉及茶多酚中兒茶素的高效液相色譜分析方法研究[J].色譜,2001,19(5):398-402.

Content determination of catechin inFragariaorientalisLozinsk. by RP-HPLC

LiRong1,LiuHai-qing2,YangChun-tao1,JiangZhi-yong1,GuoJun-ming1,LuoGui-fa2,HuangXiang-zhong1,*

(1. Key Laboratory of National Medicine Supported Jointly By State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education,Yunnan University of Nationalities,Kunming 650500,China;2. Qinghai Provincial Institute For Food and Drug Control,Xining 810016,China)

The purpose was to establish the method of(+)-catechin inFragariaorientalisLozinsk. The samples were performed on Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm)column,eluted gradiently with mixture of acetonitrile-0.1% phosphate solution at a flow rate of 1mL/min,and detected at 280nm. With this method,(+)-catechin in 10 batches ofF.orientalisLozinsk. was determined. Results showed that(+)-catechin retention time was 14.543min. The calibration curves had good linearity within the range of 0.0512～0.6400μg(R2=0.9999). The average recovery of(+)-catechin was 99.70%(RSD 2.67%). The method was easy and stable,and could be used for the quantitative analysis ofF.orientalisLozinsk.

FragariaorientalisLozinsk.;(+)-catechin;assay;quality control

2013-12-25 *通訊聯(lián)系人

李蓉(19 -)，碩士研究生，主要從事天然藥物活性成分及質(zhì)量控制研究。

國家藥典委員會項目(M11)；國家自然科學(xué)基金項目(21262047)；云南民族大學(xué)傳統(tǒng)傣藥藥用物質(zhì)基礎(chǔ)研究創(chuàng)新團隊。

TS207.3

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001