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(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410128；3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心,湖南長沙 410128)

臘八豆低溫后發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分變化研究

歐陽晶1,2,楊俊換1,蘇悟1,2,蔣立文2,3,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410128；3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心,湖南長沙 410128)

以黃豆為原料、純種毛霉發(fā)酵臘八豆后發(fā)酵過程為研究對象,利用固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)對低溫后發(fā)酵不同時(shí)段的臘八豆中揮發(fā)性成分進(jìn)行了測定。共鑒定出包括烷烴類(2)、烯烴類(29)、雜環(huán)類(6)、醇類(10)、醛類(1)、酮類(1)、酸類(2)、酯類(7)、醚類(3)等9類62種化合物。結(jié)果表明,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,雜環(huán)類、醛類、酮類等風(fēng)味化合物有所增加,醇類與酸類化合物的減少伴隨著酯類的增加,1-辛烯-3-醇等不良風(fēng)味逐漸減少,低溫發(fā)酵有利于減少褐變,促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的形成。

臘八豆,低溫發(fā)酵,揮發(fā)性成分,固相微萃取法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

臘八豆是我國南方傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一,現(xiàn)代工藝以新鮮的黃豆為原料,經(jīng)過蒸煮,接種純種毛霉、密封厭氧發(fā)酵制作而成,使得其具有風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1]。隨著對傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物發(fā)酵劑、生產(chǎn)工藝、安全控制等方面的深入研究,臘八豆風(fēng)味的產(chǎn)生與調(diào)控慢慢地引起關(guān)注。對一種產(chǎn)品而言,風(fēng)味成分是反映其質(zhì)量品質(zhì)的重要指標(biāo)。而風(fēng)味化合物除少部分天然存在于動(dòng)植物原料外,大部分則在加工過程中經(jīng)不同代謝途徑而產(chǎn)生[2]。就發(fā)酵豆制品而言,其風(fēng)味成分主要來源于發(fā)酵階段原料中的脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)經(jīng)微生物酶水解后產(chǎn)生的各類次級產(chǎn)物與小分子風(fēng)味成分,這使得不同發(fā)酵階段的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量與組成各不相同[3]。因此,分析測定不同發(fā)酵時(shí)間臘八豆的揮發(fā)性成分,將為臘八豆的生產(chǎn)工藝和風(fēng)味的調(diào)控提供有價(jià)值的信息。

工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵豆常采用恒溫后發(fā)酵技術(shù),這種后發(fā)酵方式能大幅度提高蛋白的轉(zhuǎn)化率,縮短生產(chǎn)周期。但因后發(fā)酵時(shí)間較短,風(fēng)味成分難以凝集,造成風(fēng)味缺失的現(xiàn)象[4]。低溫后發(fā)酵不僅能保證后發(fā)酵時(shí)間,使得體系中的酶系與風(fēng)味物質(zhì)得到最充分的作用與結(jié)合,并且防止褐變與抑制雜菌的作用[5]。

固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)是一種利用萃取頭表面的色譜固相相對分析組分的吸附作用對組分進(jìn)行提取與富集,再以高溫解吸附結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析鑒定的過程[6]。這種方法摒棄了液液萃取、索氏萃取等傳統(tǒng)方法的大量使用有機(jī)溶劑、填充料,處理時(shí)間長、操作步驟繁瑣等缺點(diǎn),廣泛地應(yīng)用于食品揮發(fā)性成分的測定中[7-8]?，F(xiàn)今利用SPME-GC-MS技術(shù)已經(jīng)對曲霉型、細(xì)菌型等發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分進(jìn)行了進(jìn)行了鑒定,探索出諸如吡嗪類、醇類、酚類等特征風(fēng)味物質(zhì),卻未見對于臘八豆揮發(fā)性成分探索的先例[9-10]。本研究選取后發(fā)酵30、60、90d的毛霉純種低溫發(fā)酵臘八豆作為對象,利用固相微萃取技術(shù)(SPME)提取樣品中的揮發(fā)性成分,結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS),對照計(jì)算機(jī)譜庫(Nist 2002)鑒定低溫后發(fā)酵不同階段的臘八豆中揮發(fā)性成分,以期為臘八豆品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間臘八豆揮發(fā)性成分Table 1 Volatile compounds of fermented soybean in different fermentation time

續(xù)表

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黃豆 購買于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東之源超市；M263毛霉 由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室提供。

GL-3250磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；固相微萃取(SPME)裝置 美國Supelco公司；GC/MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臘八豆的制備 市售的黃豆去雜、去癟豆,用清水洗凈,然后在室溫的條件下浸泡3～6h；將水分濾去,常壓蒸煮30min后放置在無菌的環(huán)境中自然冷卻至室溫,將制備好的純種毛霉菌種接種至熟豆中,20～25℃制曲,經(jīng)48～72h成熟后拌入適量的鹽、酒、姜、干辣椒粉于20℃的條件下進(jìn)行恒溫后發(fā)酵。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 利用SPME-GC-MS測定臘八豆低溫后發(fā)酵30、60、90d的揮發(fā)性成分。

1.2.3 揮發(fā)性成分的萃取及分析

1.2.3.1 揮發(fā)成分萃取 萃取頭的活化:為去除萃取頭上的雜質(zhì),固相微萃取之前,必須對萃取頭進(jìn)行活化。將50/30μm(DVB/CAR/PDMS)萃取頭在270℃的條件下老化1h,直至色譜檢測無干擾峰出現(xiàn)。

固相微萃取(SPME):取若干臘八豆樣品以1∶2的比例加入蒸餾水,攪打成泥狀,取9g臘八豆泥,加入至20mL的頂空進(jìn)樣瓶中,用密封墊與鋁帽進(jìn)行密封,密封后在70℃的條件下利用磁力攪拌器加熱平衡15min,將已活化的萃取頭通過隔墊插入頂空進(jìn)樣品內(nèi),推出纖維頭,使之距樣品液面約5mm,頂空吸附40min,收回纖維頭。

1.2.3.2 提取物分析 將萃取后的萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口解析5min,利用GC/MS得到總離子流色譜圖。

色譜條件:色譜柱:DB-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)；載氣:He；流速:1mL/min；進(jìn)樣口溫度:250℃；進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣；程序升溫:起始溫度為60℃,保留1min,后以6℃/min升溫至100℃,無保留,再以5℃/min升溫至200℃,無保留。

質(zhì)譜條件:離子源溫度:200℃；電離方式:EI；電子能量:70eV；燈絲電流:150μA；掃描質(zhì)量范圍45～500m/z[11]。

采用計(jì)算機(jī)譜庫(Nist 2002)檢索分析與峰面積歸一化法得到各揮發(fā)性成分名稱及相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1低溫發(fā)酵30、60、90d的臘八豆揮發(fā)性成分統(tǒng)計(jì)

低溫發(fā)酵30、60、90d的臘八豆揮發(fā)性成分質(zhì)譜圖如圖1、各揮發(fā)性成分名稱與相對含量如表1。

從圖中可知,譜圖峰形對稱,出峰勻稱,峰重疊現(xiàn)象少,不同樣品之間峰形具有明顯區(qū)別,說明SPME-GC-MS條件適宜,能客觀地反應(yīng)不同后發(fā)酵時(shí)間臘八豆的揮發(fā)性成分變化。

續(xù)表

圖1 發(fā)酵30 60、90d的臘八豆揮發(fā)性成分質(zhì)譜圖Fig.1 GC-MS chromatograms of volatile compounds of fermented soybean of 30d fermentation, 60d fermentation 90d fermentation

從臘八豆的發(fā)酵過程中共檢出62種揮發(fā)性成分,其中烷烴類化合物2種、烯烴類化合物29種、雜環(huán)類化合物6種、醇類化合物10種、醛類化合物1種、酮類化合物1種、酸類化合物2種、酯類化合物7種、醚類化合物3種。

從發(fā)酵30d的臘八豆中共檢出35種揮發(fā)性成分,其中酸類化合物2種(41.17%)；醇類化合物5種(40.97%)；烯烴類化合物19種(7.28%)；酯類化合物3種(4.18%)；雜環(huán)化合物2種(3.83%)；醛類化合物1種(1.05%)；醚類化合物2種(0.71%)；烷烴類化合物1種(0.08%)。主要香味成分包括1-丙基醋酸(41.11%)、3-甲基-2-環(huán)氧乙醇(32.25%)、桉油醇(3.84%)、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯(3.78%)、1-辛烯-3-醇(3.71%)、大蒜素(2.92%)、乙烷基己酸酯(1.39%)、苯甲醛(1.05%)。這些香氣成分占總峰面積的90.05%。

從發(fā)酵60d的臘八豆中共檢出34種揮發(fā)性成分,其中酯類化合物5種(35.06%)；醇類化合物8種(30.64%)；烯烴類化合物13種(19.5%)；醚類化合物2種(5.61%)；雜環(huán)化合物2種(5.2%)；烷烴類化合物2種(2.48%)；醛類化合物1種(1.08%)；酮類化合物1種(0.44%)；酸類化合物1種(0.05%)；。主要香味成分包括乙酸乙酯(25.6%)、戊醇(15.06%)、桉樹醇(6.0%)、乙酸異戊酯(5.79%)、二烯丙基二硫醚(5.3%)、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯(5.1%)、2-羥基丙酸酯(3.16%)、大蒜素(2.92%)、乙醇(2.84%)、β-芳樟醇(2.18%)、1-辛烯-3-醇(2.09%)、4-萜烯醇(1.34%)、苯甲醛(1.08%)、4-松油醇(1.0%)。這些香氣成分占總峰面積的79.46%。

從發(fā)酵90d的臘八豆中共檢出35種揮發(fā)性成分,其中酯類化合物5種(65.07%)；醇類化合物5種(14.41%)；雜環(huán)化合物6種(8.38%)；烯烴類化合物14種(5.55%)；醚類化合物2種(4.35%)；醛類化合物1種(1.29%)；烷烴類化合物1種(0.17%)。主要香味成分包括乙酸乙酯(48.33%)、甲酸異戊酯(10.71%)、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯(6.88%)、桉樹醇(5.76%)、乙酸異戊酯(5.44%)、乙醇(4.66%)、二烯丙基二硫醚(3.13%)、1-辛烯-3-醇(1.50%)、β-芳樟醇(1.39%)、苯甲醛(1.29%)、4-烯丙基苯甲醚(1.22%)、4-萜烯醇(1.1%)、(R)-1-甲基-4-(1,2,2-三甲基環(huán)戊基)-苯(1.0%)。這些香氣成分占總峰面積的92.41%。

2.2低溫發(fā)酵30、60、90d臘八豆揮發(fā)性成分分析

臘八豆的揮發(fā)性成分不僅包括原料大豆所含有常見的醇類、醛類[12],同時(shí)也包含后發(fā)酵過程中加入的生姜所含有的莰烯、α-姜黃烯等[13]；八角茴香中所含有的草蒿腦、石竹烯等[14]；大蒜中所含有的二烯丙基二硫醚、大蒜素等[15]物質(zhì)及酒中含有的乙醇、乙酸乙酯等化合物,并且因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶酶系水解原料中的營養(yǎng)物質(zhì)生成脂肪酸、短肽、氨基酸等進(jìn)而生產(chǎn)大量相應(yīng)雜環(huán)類、醛類、酮類等風(fēng)味化合物,這些物質(zhì)都在低溫發(fā)酵臘八豆的揮發(fā)性成分中被檢測出來。

發(fā)酵30d的臘八豆揮發(fā)性物質(zhì)主要以酸類與醇類為主,醇類物質(zhì)的產(chǎn)生可能是因?yàn)榘枇线^程中加入白酒及后發(fā)酵中酵母菌及乳酸菌等次生菌體代謝產(chǎn)生的,酸類的來源可能與大豆中油脂被微生物所產(chǎn)生的脂肪酶降解為低分子量脂肪酸,及有產(chǎn)酸微生物發(fā)酵所致[16]。醇是形成多種物質(zhì)的前體物質(zhì),有機(jī)酸經(jīng)酯酶催化生成酯類,具有芳香味。同時(shí)本身醇也可以使產(chǎn)品具備微甜醇厚的風(fēng)味[4]是極為重要的風(fēng)味物質(zhì)與風(fēng)味前提物質(zhì)之一。體系中主要揮發(fā)性成分桉油醇具有有樟腦氣息和清涼的草藥味道,大蒜素具有大蒜味與沖鼻氣味,乙烷基己酸酯具有酒香[17],這些都是臘八豆重要的風(fēng)味構(gòu)成成分。

發(fā)酵60d的臘八豆揮發(fā)性物質(zhì)主要以醇類與酯類為主,烯烴烷烴類、雜環(huán)類物質(zhì)從種類上有所減少,醇類與酯類在種類上均有一定的增加,從相對含量上,除酸類外,其他都有不同程度的增加。其中戊醇和乙酸乙酯同比發(fā)酵30d的產(chǎn)品揮發(fā)性成分有很大的增加,戊醇的增加可能依然與酵母菌與乳酸菌的代謝有關(guān),其具有酒香風(fēng)味；酯類的產(chǎn)生可能是醇與酸發(fā)生酯化反應(yīng)的結(jié)果,呈現(xiàn)出微帶果香的酒香。主要的揮發(fā)性物質(zhì)中β-芳樟醇具有花香與木香、4-萜烯醇呈暖的胡椒香、較淡的泥土香和陳腐的木材氣息,4-松油醇具似海桐花的清香,甜的紫丁香、鈴蘭氣息[17],它們都是臘八豆風(fēng)味的重要組成成分。

發(fā)酵90d后的臘八豆揮發(fā)性物質(zhì)主要以酯類為主,呈酒香與花香味的乙酸乙酯占到總揮發(fā)性成分的48.33%,醇類與酸類物質(zhì)相對含量有所減少,雜環(huán)類與醛類物質(zhì)相對含量有所增加。此發(fā)酵過程中,酯化反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行,這可能是酯類物質(zhì)含量與種類都在不斷增加而醇類與酸類物質(zhì)相對含量有所減少的原因,發(fā)酵初期體系中香辛料所含的風(fēng)味成分都有不同程度減少,而其他類物質(zhì)有所增加可能與體系復(fù)雜的生化反應(yīng)使得大分子物降解與風(fēng)味物質(zhì)的合成有關(guān)。

整個(gè)發(fā)酵過程中,一直含有的物質(zhì)有(+)-環(huán)異蒜頭烯、古巴烯、1-辛烯-3-醇、β-芳樟醇、苯甲醛等,除1-辛烯-3-醇外,其他均對臘八豆的風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)。1-辛烯-3-醇呈豆腥味,隨著發(fā)酵的進(jìn)行其含量在不斷減少。整個(gè)低溫發(fā)酵過程中,未檢測到揮發(fā)性酚與吡嗪物質(zhì)的產(chǎn)生,這可能是低溫發(fā)酵過程抑制酶促褐變的根源所在[18]。

3 結(jié)論

采用GC/MC技術(shù)測定不同發(fā)酵時(shí)間的臘八豆的揮發(fā)性成分,從臘八豆的發(fā)酵過程中共檢出包括烷烴類、烯烴類、雜環(huán)類、醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、醚類共62種揮發(fā)性成分,諸如(+)-環(huán)異蒜頭烯、古巴烯、β-芳樟醇、苯甲醛、茴香腦、松油醇等特征物質(zhì)被檢出,與黃紅霞[19]等人的研究結(jié)果相似。

隨著發(fā)酵的進(jìn)行,臘八豆中的揮發(fā)性成分在相對含量上逐漸形成,雜環(huán)類,醛類、酮類等風(fēng)味化合物無論從種類還是相對含量上均有所增加,醇類與酸類化合物的減少伴隨著酯類的增加,1-辛烯-3-醇等不良風(fēng)味逐漸減少,整個(gè)后發(fā)酵階段為檢測到揮發(fā)酚與吡嗪類物質(zhì)。說明酶促褐變程度較低,保證了酶系的充分作用及風(fēng)味物質(zhì)的生成,保障了臘八

豆風(fēng)味的形成。

但是每種揮發(fā)性香味成分的閾值相差很大,所以相對含量對風(fēng)味的影響較大,本實(shí)驗(yàn)測定了各揮發(fā)性成分的相對含量,因?yàn)榉椒ㄏ拗?無法得到各揮發(fā)性成分的香氣活性值,因此無法確定各組分化合物對臘八豆風(fēng)味的影響,這一點(diǎn)待進(jìn)一步深入研究。

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Determination of changes of volatile substances of fermented soybean in process of Low-temperature post-fermentation

OuYang-jing1,2,YangJun-huan1,SuWu1,2,JiangLi-wen2,3,*

(1.Food Science and Technology College of Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China;3.Fermented Food engineering and technology Research Center of Hunan province,Changsha 410128,China)

Soybean was chosen as material of this research,and the process of post-fermentation of fermenting soybean with Mucor was chosen as the researching object. solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry(SPME-GC-MS)were used to determine the volatile substances of fermented soybean with low-temperature fermenting condition at different time.62 volatile compounds were identified,which could be classified as 9 categories including alkanes(2),olefins(29),aromatics(6),alcohols(10),aldehydes(1),ketones(1),acids(2),esters(7),ethers(3). The results indicated that during the fermentation,the flavor compounds such as aromatics,aldehydes and ketones were increased,the contents of alcohols and acids compounds were reduced while esters compounds were increased,the contents of bad flavor 1-octen-3-ol etc were reduced gradually.Fermentation in low temperature is beneficial to reduce the browning,promote the formation of flavor substances.

fermented soybean；low-temperature fermentation；volatile components；SPME-GC-MS

2013-12-16 *通訊聯(lián)系人

歐陽晶(1989-)，男，在讀研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371828)。

TS264.2

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001