慢性牙周炎合并血管鈣化大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/h1>
2014-09-20 09:56劉桂榮潘克清
牙體牙髓牙周病學(xué)雜志 2014年5期
姜 帥，鄧 婧，劉桂榮，潘克清
(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院山東省教育廳口腔臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003)
血管鈣化是高血壓、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、糖尿病、腎病性血管病變及血管損傷老化等病理過程中普遍存在的現(xiàn)象，是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子之一，有研究認(rèn)為血管鈣化是在慢性炎癥刺激下軟組織鈣化的特殊表現(xiàn)［1］。牙周炎是一種世界范圍內(nèi)廣泛流行的慢性非特異性感染性疾病，是心血管疾病(包括AS、心肌梗塞和中風(fēng))、糖尿病、呼吸系統(tǒng)感染等的危險(xiǎn)因素［2］。但牙周炎是否對血管鈣化也有一定的促進(jìn)作用，目前尚未見詳細(xì)報(bào)道。采用合適的方法建立一種合適的動物模型，是研究牙周炎與血管鈣化的關(guān)系及其發(fā)病機(jī)制的重要條件。因此，本實(shí)驗(yàn)通過局部結(jié)扎、牙周混合致病菌感染并結(jié)合維生素D3肌注和尼古丁灌胃的方法，建立大鼠牙周炎合并血管鈣化的復(fù)合動物模型，以期為進(jìn)一步探討牙周炎與血管鈣化之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 主要材料和設(shè)備
SPF級Wistar大鼠［由青島市藥品監(jiān)督所提供，許可證號:SCXK(魯)2009 0007］;EG1160型病理組織包埋機(jī)(LEICA，德國);AB204-S分析天平(Mettler，瑞士);Unique-R20 超純水儀(Sartorius，德國);錐形束 CT(VG11077S，NewTom VG，意大利);維生素D3注射液(批號009010，上海第九制藥廠);尼古丁(sigma公司，美國);BHI液體培養(yǎng)基(青島海博);牙周混合致病菌菌懸液:采集重度慢性牙周炎患者的齦下菌斑，并參照孟祥嬌等［3］報(bào)道的方法，用BHI液體培養(yǎng)基制成細(xì)菌密度為1.5×109CFU/mL的菌懸液。
1.2 方法
1.2.1 血管鈣化合并慢性牙周炎動物模型的建立
取雄性Wistar大鼠20只(體質(zhì)量200±20)g，常規(guī)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為血管鈣化+慢性牙周炎組(VDN+CP組)、正常對照組(C組)，每組10只。所有大鼠均于禁食禁水24 h后，分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)處理。VDN+CP組大鼠在 100g/L水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉下，以4～0絲線分別結(jié)扎左、右側(cè)上頜第二磨牙牙頸部(絲線盡量置于齦溝內(nèi))，并局部接種牙周混合致病菌菌懸液(此后每周接種1次);然后參照Niederhoffer等［4］報(bào)道的血管鈣化建模方法，在實(shí)驗(yàn)第1天9∶00每只大鼠肌肉注射維生素D3(3×105U/kg)1次，并分別于9∶00和18∶00用溶有尼古丁的花生油各灌胃1次(劑量為尼古丁25 mg/kg，花生油5 mL/kg)。正常對照組大鼠按建模組相同方法麻醉后，不結(jié)扎左右上頜第二磨牙，只在局部接種等體積生理鹽水;并于實(shí)驗(yàn)第1天9∶00肌注等體積生理鹽水，9∶00和18∶00各灌胃1次花生油(5 mL/kg)。上述處理結(jié)束后，所有大鼠均在相同環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)8周，每周稱量1次體質(zhì)量，并檢查結(jié)扎情況(若絲線脫落或位于齦上時(shí)，則重新結(jié)扎)。
1.2.2 牙周臨床指標(biāo)檢查
建模結(jié)束后，由同一人使用改良牙周探針分別測量各受試牙的牙周探診深度(PD)及齦溝出血指數(shù)(SBI)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)牙各測頰側(cè)、腭側(cè)兩個(gè)位點(diǎn)，取均值。SBI評定標(biāo)準(zhǔn)采用Mazza(1981)提出的0～5分記分法，0為牙齦健康;1為牙齦輕度水腫，探診不出血;2為僅在探診處呈點(diǎn)狀出血;3為出血沿齦緣擴(kuò)展;4為出血溢出齦緣;5有自發(fā)出血傾向或潰瘍形成。
1.2.3 牙槽骨喪失情況觀察
建模結(jié)束(8周)后處死所有大鼠，分別解剖取出其含第二磨牙的雙側(cè)上頜骨，并浸泡于1mol/L的氫氧化鈉溶液中。待軟組織去凈后，肉眼觀察各實(shí)驗(yàn)牙的牙槽骨吸收情況;然后再用CBCT對其進(jìn)行掃描(電壓80 Kv，電流6.2 mA，掃描范圍16 cm×7 cm，分辨率為0.2 mm)。所采集的數(shù)據(jù)用CT機(jī)器自帶程序進(jìn)行影像重建后，采用Profile tools軟件測量各實(shí)驗(yàn)牙釉-牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x。
1.2.4 心臟重量及心重指數(shù)測定
解剖各大鼠并立即摘取其心臟，生理鹽水徹底清洗后剪去血管，并用濾紙吸去殘留血液;然后稱量全心重量，以全心重/體質(zhì)量(HW/BW)作為該大鼠的心重指數(shù)。
1.2.5 胸主動脈HE染色觀察
取各大鼠的胸主動脈全長，用40 g/L多聚甲醛固定后，石蠟包埋、連續(xù)切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察血管的組織病理學(xué)變化。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
2.1 兩組大鼠牙周臨床指標(biāo)比較
建模結(jié)束后，正常對照組(C組)牙周組織正常，牙齦呈粉紅色，質(zhì)地致密堅(jiān)韌，無齦溝出血情況，無炎性改變;VDN+CP組實(shí)驗(yàn)牙則出現(xiàn)明顯的牙周炎癥，牙齦紅腫，探診易出血，SBI和PD均明顯高于C組(P＜0.05)(表1)。
表1 兩組動物SBI和PD比較(n=10，s)
表1 兩組動物SBI和PD比較(n=10，s)
*與C組相比P＜0.05
組別 SBI PD(mm)0.5±0.52 0.16±0.07 VDN+CP 3.2±0.78* 1.22±0.33 C*
2.2 兩組大鼠牙槽骨喪失情況比較
建模8周后取各組大鼠帶有3個(gè)磨牙的上頜骨，肉眼觀察可見C組牙槽骨無明顯吸收，牙槽嵴高度無明顯降低;而VDN+CP組牙槽嵴高度則較C組明顯降低，部分標(biāo)本牙槽骨吸收近根尖(圖1)。
采用Cone beam CT對各組頜骨標(biāo)本進(jìn)行掃描，并重建牙齒、牙槽骨硬組織表面影像，則可更直觀地比較兩組牙槽骨的骨喪失情況(圖2)。利用profile tools軟件測量各組實(shí)驗(yàn)牙釉-牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂點(diǎn)的距離顯示，VDN+CP組的牙槽骨吸收值明顯高于C組(P＜0.05)(表2)。
圖1 肉眼觀兩組牙槽骨喪失情況
圖2 CBCT觀察兩組牙槽骨喪失情況
表2 兩組牙槽骨吸收值比較(n=10，s)
表2 兩組牙槽骨吸收值比較(n=10，s)
*與C組相比P＜0.05
分組 牙槽骨吸收值(mm)0.28±0.08 VDN+CP 1.46±0.22 C*
2.3 胸主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察
正常對照組胸主動脈HE染色觀察顯示，其內(nèi)外壁輪廓平滑而完整，管壁呈厚度均勻的環(huán)形排列，且染色深淺基本一致;管腔內(nèi)未見血栓形成和脫落的壞死組織;內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚，內(nèi)膜較薄，表面為單層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋;中膜壁較厚，并含有多層呈波浪狀平行排列的彈性膜，彈性膜之間夾雜平滑肌纖維和膠原纖維;外膜較薄，為疏松結(jié)締組織(圖3a)。
VDN+CP組胸主動脈HE染色觀察顯示，其內(nèi)外壁可見輪廓凹凸不平的灶狀病變，管壁厚薄不均，染色深淺不一;內(nèi)膜部分已被破壞，細(xì)胞排列紊亂;中膜部分區(qū)域有明顯萎縮，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，且排列疏松、相互交織，延展性降低;平滑肌細(xì)胞減少或萎縮，且排列紊亂并與彈力纖維層分離，部分胞漿出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞核呈變圓或固縮成點(diǎn)、線狀甚至消失，核仁不清;有部分中膜的平滑肌細(xì)胞移入內(nèi)膜，并增生產(chǎn)生結(jié)締組織，使內(nèi)膜增厚(圖3b)。
圖3 兩組胸主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察(HE×20)
2.4 兩組心臟重量及心重指數(shù)比較
建模結(jié)束后，取各大鼠的心臟進(jìn)行稱重顯示，VDN+CP組大鼠的心臟重量(HW)及心重指數(shù)(HW/BW)均明顯高于對照組(P＜0.05)(表3)。
表3 各組大鼠心臟重量和心重指數(shù)的比較(n=10，s)
表3 各組大鼠心臟重量和心重指數(shù)的比較(n=10，s)
*與對照組相比P＜0.05
組別 體質(zhì)量(g)心重(g)心重指數(shù)C 419.2±10.73 1.15±0.45 0.0027±0.0001 VDN+CP 398.6±10.88 1.30±0.55* 0.0033±0.0001*
3 討論
血管鈣化作為心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子，普遍存在于動脈粥樣硬化、高血壓、腎病性血管病變以及血管損傷、老化等病理過程中。既往認(rèn)為，血管鈣化是被動的過程，作為與衰老伴行的退行性病變，是血管老化的標(biāo)志。但近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化的形成過程與骨發(fā)育類似，是一種可高度調(diào)控的生物學(xué)過程［5-6］。有研究認(rèn)為，血管鈣化是在慢性炎癥刺激下軟組織鈣化的特殊表現(xiàn)［1］。牙周炎是一種慢性非特異性感染性疾病，不僅可破壞牙周組織，導(dǎo)致牙周袋形成、牙齒松動移位，而且有炎癥的牙周組織中的細(xì)菌及其產(chǎn)物更易進(jìn)入外周血及深層組織，大量的炎癥介質(zhì)也會隨著血液循環(huán)與全身各重要器官、系統(tǒng)相互作用，誘發(fā)或加重某些全身系統(tǒng)性疾病。Egelberg等報(bào)道，牙周損害可以促進(jìn)牙周致病菌在全身的播散［7］。封艷等也報(bào)道，宿主對細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物刺激的免疫炎癥反應(yīng)不僅可使牙周組織受到破壞，異常的炎癥反應(yīng)還會增加患糖尿病和心血管疾病的危險(xiǎn)性［8］。但牙周炎是否與血管鈣化有一定的相關(guān)性，目前尚未見詳細(xì)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，通過絲線結(jié)扎牙頸部、局部接種牙周混合致病菌，并結(jié)合維生素D3肌注和尼古丁灌胃，建立牙周炎合并血管鈣化的復(fù)合動物模型，以期探討牙周疾病與血管鈣化的相關(guān)性。
關(guān)于牙周炎動物模型的制備方法，國內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道，目前常用的方法是采用全身因素或局部刺激［9］。全身因素主要采用免疫抑制劑、激素等;局部刺激因素主要采用高糖飲食、結(jié)扎、手術(shù)刺激、接種牙周特異致病菌等。但是，采用全身因素的制備方法容易破壞動物的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致某些細(xì)胞因子的異常表達(dá)，從而使測量指標(biāo)出現(xiàn)偏差。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了絲線結(jié)扎+局部接種牙周致病菌的方法［9-111］，使實(shí)驗(yàn)大鼠口腔的病變過程更符合臨床常見的牙周炎的發(fā)病過程。結(jié)果表明，建模組的牙周探診深度(PD)、齦溝出血指數(shù)(SBI)以及牙槽骨喪失值均明顯高于正常對照組(P＜0.05)，說明實(shí)驗(yàn)動物形成了慢性牙周炎。
目前制備鼠血管鈣化模型的方法主要有藥物誘導(dǎo)、基因敲除、慢性腎功能衰竭和高脂飲食近交培育等4種。其中，藥物誘導(dǎo)與另3種其他建模方法相比，具有操作簡便、建模周期相對較短、成活率高，成本較低的優(yōu)點(diǎn)，是目前制備血管鈣化動物模型的首選［12］。而且，華法令、維生素 D3、尼古丁、氯化鈣等藥物的單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均可誘導(dǎo)大鼠和小鼠形成動脈鈣化。因此，本實(shí)驗(yàn)參照Niederhoffer等［4］報(bào)道的方法，采用維生素D3肌注聯(lián)合尼古丁灌胃制備大鼠血管鈣化模型，其中大劑量維生素D3可增加動脈組織中鈣的含量［13］;而尼古丁不僅可損傷動脈血管組織，同時(shí)還可使維生素D3的作用進(jìn)一步增強(qiáng)［14］，二者合用可造成動脈鈣超載，引起動脈中膜、彈性纖維鈣沉積，最終形成血管鈣化。
有研究表明，心肌功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變與長期血管鈣化也有密切關(guān)系，本結(jié)果顯示，VDN+CP組大鼠的心臟重量及心重指數(shù)均明顯高于對照組(P＜0.05)，說明VDN+CP組大鼠可能發(fā)生心肌肥大的現(xiàn)象，與以往的相關(guān)研究結(jié)果一致［15］，但牙周炎是否會加重此現(xiàn)象，還需要進(jìn)一步研究觀察。
結(jié)合牙周臨床指標(biāo)檢查、錐形束CT掃描以及心血管組織病理學(xué)觀察等綜合判定，通過維生素D3肌注+尼古丁溶于花生油灌胃法和絲線結(jié)扎+細(xì)菌接種的方法可成功建立實(shí)驗(yàn)所需的動物模型，該模型可用于牙周炎與血管鈣化相關(guān)性的進(jìn)一步研究。
［1］Li JJ，Zhu CG，Yu B，et al.The role of inflammation in coronary artery calcification ［J］.Ageing Res Rev，2007，6(4):263-270.
［2］Gulati M，Anand V，Jain N，et al.Essentials of periodontal medicine in preventive medicine［J］.Int J Prev Med，2013，9(4):988-994.
［3］孟祥嬌，于新波，鄧婧.氫飽和水對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎抗炎作用的初步觀察［J］.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2012，27(4):358-360.
［4］Niederhoffer N，Bobryshev YV，Lartaud-Idjouadiene I，et al.Aortic calcification produced by vitamin D3 plus nicotine［J］.Vasc Res，1997，34(5):386-398.
［5］Wallin R，Wajih N，Greenwood GT，et al.Arterial calcification:A review of mechanisms，animal models，and the prospects for therapy［J］.Med Res Rev，2001，21(4):274-301.
［6］Mody N，Tintut Y，Radcliff K，et al.Vascular calcification and its relation to bone calcification:possible underlying mechanisms［J］.Nucl Cardiol，2003，10(2):177-183.
［7］Egelberg J.Local effect of diet on plaque formation and development of gingivitis in dogs.Effect of hard and soft diets［J］.Odontol Revy，1965，16:31-41.
［8］封艷，鐘良軍，張?jiān)疵?牙周炎與動脈粥樣硬化［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2005，15(12):699-702.
［9］史鳳芹，于世鳳，龐淑珍.牙周炎動物模型初步研究［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，1994，29(1):50-52.
［10］Jain A，Batista EL，Serhan C，et al.Role for periodontitis in the progression of lipid deposition in an animal model［J］.Infect Immun，2003，71(10):6012-6018.
［11］王曉敏，于世鳳.牙周炎動物模型的建立及技術(shù)關(guān)鍵［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，1999，9(1):89-91.
［12］段曉輝，齊永芬，唐朝樞.血管鈣化動物模型的研究進(jìn)展［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16(2):153-157.
［13］Wang SY，Zhou HH.The effect of vitamin D receptor in intestinal tract tissue ［J］.China Pharmacol Bull，2007，23(2):151-154.
［14］Grases F，Sanchis P，Perell J，et al.Effect of crystal lization in hibitorson vascular c-alcifications induced by vitamin D:apilot study in Sprague Dawley rats［J］.Circ J，2007，71(7):1152-1156.
［15］Jegger D，Silve R，Jeanrenaud X，et al.Ventricular-arterial coupling in a rat model of reduced arterial compliance provoked by hypervitaminosis D and nicotine［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291(4):H1942-1951.
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1 材料和方法
1.1 主要材料和設(shè)備
SPF級Wistar大鼠［由青島市藥品監(jiān)督所提供，許可證號:SCXK(魯)2009 0007］;EG1160型病理組織包埋機(jī)(LEICA，德國);AB204-S分析天平(Mettler，瑞士);Unique-R20 超純水儀(Sartorius，德國);錐形束 CT(VG11077S，NewTom VG，意大利);維生素D3注射液(批號009010，上海第九制藥廠);尼古丁(sigma公司，美國);BHI液體培養(yǎng)基(青島海博);牙周混合致病菌菌懸液:采集重度慢性牙周炎患者的齦下菌斑，并參照孟祥嬌等［3］報(bào)道的方法，用BHI液體培養(yǎng)基制成細(xì)菌密度為1.5×109CFU/mL的菌懸液。
1.2 方法
1.2.1 血管鈣化合并慢性牙周炎動物模型的建立
取雄性Wistar大鼠20只(體質(zhì)量200±20)g，常規(guī)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為血管鈣化+慢性牙周炎組(VDN+CP組)、正常對照組(C組)，每組10只。所有大鼠均于禁食禁水24 h后，分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)處理。VDN+CP組大鼠在 100g/L水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉下，以4～0絲線分別結(jié)扎左、右側(cè)上頜第二磨牙牙頸部(絲線盡量置于齦溝內(nèi))，并局部接種牙周混合致病菌菌懸液(此后每周接種1次);然后參照Niederhoffer等［4］報(bào)道的血管鈣化建模方法，在實(shí)驗(yàn)第1天9∶00每只大鼠肌肉注射維生素D3(3×105U/kg)1次，并分別于9∶00和18∶00用溶有尼古丁的花生油各灌胃1次(劑量為尼古丁25 mg/kg，花生油5 mL/kg)。正常對照組大鼠按建模組相同方法麻醉后，不結(jié)扎左右上頜第二磨牙，只在局部接種等體積生理鹽水;并于實(shí)驗(yàn)第1天9∶00肌注等體積生理鹽水，9∶00和18∶00各灌胃1次花生油(5 mL/kg)。上述處理結(jié)束后，所有大鼠均在相同環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)8周，每周稱量1次體質(zhì)量，并檢查結(jié)扎情況(若絲線脫落或位于齦上時(shí)，則重新結(jié)扎)。
1.2.2 牙周臨床指標(biāo)檢查
建模結(jié)束后，由同一人使用改良牙周探針分別測量各受試牙的牙周探診深度(PD)及齦溝出血指數(shù)(SBI)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)牙各測頰側(cè)、腭側(cè)兩個(gè)位點(diǎn)，取均值。SBI評定標(biāo)準(zhǔn)采用Mazza(1981)提出的0～5分記分法，0為牙齦健康;1為牙齦輕度水腫，探診不出血;2為僅在探診處呈點(diǎn)狀出血;3為出血沿齦緣擴(kuò)展;4為出血溢出齦緣;5有自發(fā)出血傾向或潰瘍形成。
1.2.3 牙槽骨喪失情況觀察
建模結(jié)束(8周)后處死所有大鼠，分別解剖取出其含第二磨牙的雙側(cè)上頜骨，并浸泡于1mol/L的氫氧化鈉溶液中。待軟組織去凈后，肉眼觀察各實(shí)驗(yàn)牙的牙槽骨吸收情況;然后再用CBCT對其進(jìn)行掃描(電壓80 Kv，電流6.2 mA，掃描范圍16 cm×7 cm，分辨率為0.2 mm)。所采集的數(shù)據(jù)用CT機(jī)器自帶程序進(jìn)行影像重建后，采用Profile tools軟件測量各實(shí)驗(yàn)牙釉-牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x。
1.2.4 心臟重量及心重指數(shù)測定
解剖各大鼠并立即摘取其心臟，生理鹽水徹底清洗后剪去血管，并用濾紙吸去殘留血液;然后稱量全心重量，以全心重/體質(zhì)量(HW/BW)作為該大鼠的心重指數(shù)。
1.2.5 胸主動脈HE染色觀察
取各大鼠的胸主動脈全長，用40 g/L多聚甲醛固定后，石蠟包埋、連續(xù)切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察血管的組織病理學(xué)變化。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
2.1 兩組大鼠牙周臨床指標(biāo)比較
建模結(jié)束后，正常對照組(C組)牙周組織正常，牙齦呈粉紅色，質(zhì)地致密堅(jiān)韌，無齦溝出血情況，無炎性改變;VDN+CP組實(shí)驗(yàn)牙則出現(xiàn)明顯的牙周炎癥，牙齦紅腫，探診易出血，SBI和PD均明顯高于C組(P＜0.05)(表1)。
表1 兩組動物SBI和PD比較(n=10，s)
表1 兩組動物SBI和PD比較(n=10，s)
*與C組相比P＜0.05
組別 SBI PD(mm)0.5±0.52 0.16±0.07 VDN+CP 3.2±0.78* 1.22±0.33 C*
2.2 兩組大鼠牙槽骨喪失情況比較
建模8周后取各組大鼠帶有3個(gè)磨牙的上頜骨，肉眼觀察可見C組牙槽骨無明顯吸收，牙槽嵴高度無明顯降低;而VDN+CP組牙槽嵴高度則較C組明顯降低，部分標(biāo)本牙槽骨吸收近根尖(圖1)。
采用Cone beam CT對各組頜骨標(biāo)本進(jìn)行掃描，并重建牙齒、牙槽骨硬組織表面影像，則可更直觀地比較兩組牙槽骨的骨喪失情況(圖2)。利用profile tools軟件測量各組實(shí)驗(yàn)牙釉-牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂點(diǎn)的距離顯示，VDN+CP組的牙槽骨吸收值明顯高于C組(P＜0.05)(表2)。
圖1 肉眼觀兩組牙槽骨喪失情況
圖2 CBCT觀察兩組牙槽骨喪失情況
表2 兩組牙槽骨吸收值比較(n=10，s)
表2 兩組牙槽骨吸收值比較(n=10，s)
*與C組相比P＜0.05
分組 牙槽骨吸收值(mm)0.28±0.08 VDN+CP 1.46±0.22 C*
2.3 胸主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察
正常對照組胸主動脈HE染色觀察顯示，其內(nèi)外壁輪廓平滑而完整，管壁呈厚度均勻的環(huán)形排列，且染色深淺基本一致;管腔內(nèi)未見血栓形成和脫落的壞死組織;內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚，內(nèi)膜較薄，表面為單層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋;中膜壁較厚，并含有多層呈波浪狀平行排列的彈性膜，彈性膜之間夾雜平滑肌纖維和膠原纖維;外膜較薄，為疏松結(jié)締組織(圖3a)。
VDN+CP組胸主動脈HE染色觀察顯示，其內(nèi)外壁可見輪廓凹凸不平的灶狀病變，管壁厚薄不均，染色深淺不一;內(nèi)膜部分已被破壞，細(xì)胞排列紊亂;中膜部分區(qū)域有明顯萎縮，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，且排列疏松、相互交織，延展性降低;平滑肌細(xì)胞減少或萎縮，且排列紊亂并與彈力纖維層分離，部分胞漿出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞核呈變圓或固縮成點(diǎn)、線狀甚至消失，核仁不清;有部分中膜的平滑肌細(xì)胞移入內(nèi)膜，并增生產(chǎn)生結(jié)締組織，使內(nèi)膜增厚(圖3b)。
圖3 兩組胸主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察(HE×20)
2.4 兩組心臟重量及心重指數(shù)比較
建模結(jié)束后，取各大鼠的心臟進(jìn)行稱重顯示，VDN+CP組大鼠的心臟重量(HW)及心重指數(shù)(HW/BW)均明顯高于對照組(P＜0.05)(表3)。
表3 各組大鼠心臟重量和心重指數(shù)的比較(n=10，s)
表3 各組大鼠心臟重量和心重指數(shù)的比較(n=10，s)
*與對照組相比P＜0.05
組別 體質(zhì)量(g)心重(g)心重指數(shù)C 419.2±10.73 1.15±0.45 0.0027±0.0001 VDN+CP 398.6±10.88 1.30±0.55* 0.0033±0.0001*
3 討論
血管鈣化作為心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子，普遍存在于動脈粥樣硬化、高血壓、腎病性血管病變以及血管損傷、老化等病理過程中。既往認(rèn)為，血管鈣化是被動的過程，作為與衰老伴行的退行性病變，是血管老化的標(biāo)志。但近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化的形成過程與骨發(fā)育類似，是一種可高度調(diào)控的生物學(xué)過程［5-6］。有研究認(rèn)為，血管鈣化是在慢性炎癥刺激下軟組織鈣化的特殊表現(xiàn)［1］。牙周炎是一種慢性非特異性感染性疾病，不僅可破壞牙周組織，導(dǎo)致牙周袋形成、牙齒松動移位，而且有炎癥的牙周組織中的細(xì)菌及其產(chǎn)物更易進(jìn)入外周血及深層組織，大量的炎癥介質(zhì)也會隨著血液循環(huán)與全身各重要器官、系統(tǒng)相互作用，誘發(fā)或加重某些全身系統(tǒng)性疾病。Egelberg等報(bào)道，牙周損害可以促進(jìn)牙周致病菌在全身的播散［7］。封艷等也報(bào)道，宿主對細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物刺激的免疫炎癥反應(yīng)不僅可使牙周組織受到破壞，異常的炎癥反應(yīng)還會增加患糖尿病和心血管疾病的危險(xiǎn)性［8］。但牙周炎是否與血管鈣化有一定的相關(guān)性，目前尚未見詳細(xì)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，通過絲線結(jié)扎牙頸部、局部接種牙周混合致病菌，并結(jié)合維生素D3肌注和尼古丁灌胃，建立牙周炎合并血管鈣化的復(fù)合動物模型，以期探討牙周疾病與血管鈣化的相關(guān)性。
關(guān)于牙周炎動物模型的制備方法，國內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道，目前常用的方法是采用全身因素或局部刺激［9］。全身因素主要采用免疫抑制劑、激素等;局部刺激因素主要采用高糖飲食、結(jié)扎、手術(shù)刺激、接種牙周特異致病菌等。但是，采用全身因素的制備方法容易破壞動物的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致某些細(xì)胞因子的異常表達(dá)，從而使測量指標(biāo)出現(xiàn)偏差。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了絲線結(jié)扎+局部接種牙周致病菌的方法［9-111］，使實(shí)驗(yàn)大鼠口腔的病變過程更符合臨床常見的牙周炎的發(fā)病過程。結(jié)果表明，建模組的牙周探診深度(PD)、齦溝出血指數(shù)(SBI)以及牙槽骨喪失值均明顯高于正常對照組(P＜0.05)，說明實(shí)驗(yàn)動物形成了慢性牙周炎。
目前制備鼠血管鈣化模型的方法主要有藥物誘導(dǎo)、基因敲除、慢性腎功能衰竭和高脂飲食近交培育等4種。其中，藥物誘導(dǎo)與另3種其他建模方法相比，具有操作簡便、建模周期相對較短、成活率高，成本較低的優(yōu)點(diǎn)，是目前制備血管鈣化動物模型的首選［12］。而且，華法令、維生素 D3、尼古丁、氯化鈣等藥物的單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均可誘導(dǎo)大鼠和小鼠形成動脈鈣化。因此，本實(shí)驗(yàn)參照Niederhoffer等［4］報(bào)道的方法，采用維生素D3肌注聯(lián)合尼古丁灌胃制備大鼠血管鈣化模型，其中大劑量維生素D3可增加動脈組織中鈣的含量［13］;而尼古丁不僅可損傷動脈血管組織，同時(shí)還可使維生素D3的作用進(jìn)一步增強(qiáng)［14］，二者合用可造成動脈鈣超載，引起動脈中膜、彈性纖維鈣沉積，最終形成血管鈣化。
有研究表明，心肌功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變與長期血管鈣化也有密切關(guān)系，本結(jié)果顯示，VDN+CP組大鼠的心臟重量及心重指數(shù)均明顯高于對照組(P＜0.05)，說明VDN+CP組大鼠可能發(fā)生心肌肥大的現(xiàn)象，與以往的相關(guān)研究結(jié)果一致［15］，但牙周炎是否會加重此現(xiàn)象，還需要進(jìn)一步研究觀察。
結(jié)合牙周臨床指標(biāo)檢查、錐形束CT掃描以及心血管組織病理學(xué)觀察等綜合判定，通過維生素D3肌注+尼古丁溶于花生油灌胃法和絲線結(jié)扎+細(xì)菌接種的方法可成功建立實(shí)驗(yàn)所需的動物模型，該模型可用于牙周炎與血管鈣化相關(guān)性的進(jìn)一步研究。
［1］Li JJ，Zhu CG，Yu B，et al.The role of inflammation in coronary artery calcification ［J］.Ageing Res Rev，2007，6(4):263-270.
［2］Gulati M，Anand V，Jain N，et al.Essentials of periodontal medicine in preventive medicine［J］.Int J Prev Med，2013，9(4):988-994.
［3］孟祥嬌，于新波，鄧婧.氫飽和水對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎抗炎作用的初步觀察［J］.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2012，27(4):358-360.
［4］Niederhoffer N，Bobryshev YV，Lartaud-Idjouadiene I，et al.Aortic calcification produced by vitamin D3 plus nicotine［J］.Vasc Res，1997，34(5):386-398.
［5］Wallin R，Wajih N，Greenwood GT，et al.Arterial calcification:A review of mechanisms，animal models，and the prospects for therapy［J］.Med Res Rev，2001，21(4):274-301.
［6］Mody N，Tintut Y，Radcliff K，et al.Vascular calcification and its relation to bone calcification:possible underlying mechanisms［J］.Nucl Cardiol，2003，10(2):177-183.
［7］Egelberg J.Local effect of diet on plaque formation and development of gingivitis in dogs.Effect of hard and soft diets［J］.Odontol Revy，1965，16:31-41.
［8］封艷，鐘良軍，張?jiān)疵?牙周炎與動脈粥樣硬化［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2005，15(12):699-702.
［9］史鳳芹，于世鳳，龐淑珍.牙周炎動物模型初步研究［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，1994，29(1):50-52.
［10］Jain A，Batista EL，Serhan C，et al.Role for periodontitis in the progression of lipid deposition in an animal model［J］.Infect Immun，2003，71(10):6012-6018.
［11］王曉敏，于世鳳.牙周炎動物模型的建立及技術(shù)關(guān)鍵［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，1999，9(1):89-91.
［12］段曉輝，齊永芬，唐朝樞.血管鈣化動物模型的研究進(jìn)展［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16(2):153-157.
［13］Wang SY，Zhou HH.The effect of vitamin D receptor in intestinal tract tissue ［J］.China Pharmacol Bull，2007，23(2):151-154.
［14］Grases F，Sanchis P，Perell J，et al.Effect of crystal lization in hibitorson vascular c-alcifications induced by vitamin D:apilot study in Sprague Dawley rats［J］.Circ J，2007，71(7):1152-1156.
［15］Jegger D，Silve R，Jeanrenaud X，et al.Ventricular-arterial coupling in a rat model of reduced arterial compliance provoked by hypervitaminosis D and nicotine［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291(4):H1942-1951.
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