雒可夫，劉文佳，陳吉華，金 巖

(陜西西安710032:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室;2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程研究中心軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室)

當(dāng)下，組織工程與再生醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，給口腔醫(yī)學(xué)帶來了新的變革和生機;隨著組織工程皮膚［1］、骨［2］和牙齒［3］等概念的提出及其部分相關(guān)產(chǎn)品的面世，更為口腔醫(yī)學(xué)的發(fā)展開辟了新的思路和空間。在組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究中，種子細胞是其必要的條件之一，其中骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)因其具有的多向分化潛能［4］，且來源豐富、易于獲得等優(yōu)勢，常被作為組織工程的種子細胞，并越來越受到重視。

BMMSCs在自我更新、分化和衰老過程中，受到了多種機制的精細調(diào)控，其中一些胚胎干細胞標(biāo)記物，如Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ等均與干細胞的自我更新、分化潛能等有著密切的關(guān)系［5］。有實驗［6］證實，增加Nanog和Oct-4在干細胞中的表達，能有效促進細胞增殖并增強其集落形成的能力，而這一現(xiàn)象又被認為與細胞干性的維持息息相關(guān)。

自噬是廣泛存在于真核生物中的一種細胞自我保護機制［7］，在這個過程中，細胞中冗余的細胞器、錯誤折疊的蛋白以及代謝過程中產(chǎn)生的廢物等，都可以被雙層脂質(zhì)膜包裹而形成自噬小體，并經(jīng)由溶酶體降解成可供細胞循環(huán)利用的氨基酸、甘油三酯等小分子。這種通過自噬的細胞自我保護機制可維持細胞的穩(wěn)態(tài)，并提高其在逆境下生存能力［8］。但是，自噬的活性也會隨著細胞的衰老而逐漸減弱，因此，自噬的活性水平也被認為是衡量細胞年輕態(tài)的重要指標(biāo)。在對果蠅、酵母菌和秀麗線蟲等低等生物進行研究時發(fā)現(xiàn)，通過提高細胞的自噬水平，確實能延長其機體的平均壽命［9］。

正如很多文獻中報道的一樣，細胞的干性也會隨著衰老而逐漸退化，并開始喪失多向分化潛力，成骨、成脂效率減慢［10］。但目前尚未見將干細胞的自噬活動與細胞干性的維持相聯(lián)系起來的有關(guān)報道。本研究試圖通過改變小鼠BMMSCs的自噬水平，觀察其干性標(biāo)記基因表達的差異，探討兩者之間的關(guān)系，以期為更好地維護BMMSCs在體外的良好狀態(tài)和分化潛能打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

C57BL/6小鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供);α-MEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺(Gibco，美國);胎牛血清(杭州四季青);抗CD90.2、抗 CD29、抗 SCA-1、抗 CD31、抗 CD146、抗CD11b抗體(Biolegend，美國);Trizol Reagent(Life Technologies，美國);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)、相關(guān)基因引物(上海生物工程公司);SYBR-ⅡGreen熒光定量試劑(Takara，日本);PMSF試劑、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天);抗 beclin 1、抗 atg 7、抗 atg12、抗 LC-3 抗體、兔二抗、鼠二抗(Cell Signaling，美國);抗 β-Actin鼠單克隆抗體(北京康為世紀);PVDF膜(DUPONT，美國);ECL免疫熒光發(fā)光試劑(上海七海生物);X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(Roche，美國);RNA oligo(上海吉瑪基因);CO2恒溫孵箱(Forma，美國);YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus Optical，日本);流式細胞儀(Beckman-Coulter，美國);紫外分光光度儀(NanoDrop?ND-1000，美國);PCR擴增儀(BioMetra，德國);Real-time PCR儀(Applied Biosystems，美國);高速離心機(Kubota2100，日本);6孔、12孔培養(yǎng)板(Falcon，美國);9 cm直徑細胞培養(yǎng)皿(Corning，Lowell，美國);電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD，美國);Tanon掃描分析系統(tǒng)(上海天能)。

1.2 小鼠BMMSCs的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 小鼠BMMSCs的分離和培養(yǎng)

取8～9周齡C57BL/6小鼠，脫頸處死后置于750 mL/L的乙醇中浸泡消毒10 min;超凈工作臺內(nèi)解剖、分離出小鼠的股骨、脛骨，并剪去兩端骨組織;然后用裝有α-MEM培養(yǎng)液的1mL注射器沖出骨髓，并將其置于盛有10 mL α-MEM培養(yǎng)液(含200 mL/L胎牛血清以及100 U/mL青霉素、鏈霉素)的直徑為90 mm的塑料培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打至無肉眼可見的細胞團塊后，置于37℃、飽和濕度的50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天首次半量換液，而后每兩天1次半量換液;并用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。待貼壁細胞融合達80%～90%時，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次;用2.5 g/L胰酶37℃下消化3 min后，加入等體積α-MEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)，并以2.5×104/cm2的密度進行傳代。

1.2.2 小鼠BMMSCs的表型鑒定

取P3代小鼠BMMSCs，胰酶消化后制成密度為3.25×106/mL的細胞懸液，并分裝于EP管中(100 μL/管)。按照試劑公司說明書推薦的比例，分別在各管中添加抗CD90.2、抗CD29、抗SCA-1、抗CD31、抗CD146和抗CD11b抗體(設(shè)不加抗體的空白管作為對照)后，4℃條件下避光孵育1 h;然后離心收集細胞，并用PBS清洗兩遍;最后用200 μL PBS重懸細胞，流失細胞儀檢測標(biāo)記抗體陽性細胞所占的百分比。

1.3 激活小鼠BMMSCs自噬的實驗觀察

1.3.1 實驗分組和處理

取P1代小鼠BMMSCs接種于12孔板(3×105/孔)和6孔板(5×105/孔)，常規(guī)培養(yǎng) 12 h待細胞貼壁后，棄原液，并分別將12孔板和6孔板中的細胞各隨機分為兩組(實驗組和對照組);實驗組加入含雷帕霉素終濃度為20 nmol/L的α-MEM培養(yǎng)液，對照組加入常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，用相差顯微鏡觀察各種細胞的形態(tài)變化，并分別檢測各組自噬相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達水平。

1.3.2 RT-PCR檢測各自噬相關(guān)基因的表達水平

取上述培養(yǎng)24 h的12孔板，PBS清洗兩遍后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，并用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。然后以cDNA為模板、β-actin為內(nèi)參，用RT-PCR儀分別檢測atg-7、atg-12、beclin 1、LC-3 mRNA的表達水平，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)條件嚴格按照產(chǎn)品說明，所用引物及其序列見表2。

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

表2 各自噬相關(guān)基因引物及其序列

1.3.3 Western-blot檢測各自噬相關(guān)基因的蛋白表達水平

取上述培養(yǎng)24 h后的6孔板，PBS沖洗兩遍后，每孔中各加150 μL含1%PMSF的細胞裂解液裂解細胞(-80℃冰箱反復(fù)凍融3次，冰浴超聲裂解)，并提取細胞總蛋白。用BCA試劑盒對蛋白進行定量后，取等量樣品以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L的牛血清白蛋白封閉液封閉2 h;分別滴加 atg-7、atg-12、beclin 1、LC-3、β-actin 一抗封閉過夜后，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉2 h;ECL發(fā)光試劑顯色，利用Tanon掃描分析系統(tǒng)進行觀察，并記錄實驗結(jié)果。

1.3.4 激活小鼠BMMSCs后干性標(biāo)記基因的表達

取上述培養(yǎng)24 h的12孔板，按1.3.2相同的操作步驟提取細胞總RNA，并用RT-PCR儀分別檢測實驗組和對照組細胞的各干性標(biāo)記基因Nanog、Oct-4、Sox-ⅡmRNA 的表達水平。所用引物及其序列見表3。

表3 各干性標(biāo)記基因引物及其序列

1.4 抑制小鼠BMMSCs自噬的實驗觀察

1.4.1 抑制自噬對自噬相關(guān)基因表達影響的觀察

1.4.1.1 實驗分組和處理

取P1代小鼠 BMMSCs接種于12孔板(3×105/孔)，常規(guī)培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，棄原液，并將細胞隨機分為3組(實驗組、正常對照組和陰性對照組)。實驗組先用無雙抗的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h后，再用可靶向作用于beclin 1的si-RNA(小分子干擾RNA)對細胞進行轉(zhuǎn)染，具體方法如下:取RNA oligo和轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，按使用說明分別用 50 μL 無雙抗無血清的α-MEM培養(yǎng)液稀釋后，將兩者混合制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，常溫下孵育15 min后加入到實驗組各孔中，并使 RNA oligo的終濃度為100 nmol/L，轉(zhuǎn)染試劑的終濃度為250 nmol/L;然后在常規(guī)培養(yǎng)條件下進行轉(zhuǎn)染，8 h后更換普通α-MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，正常對照組加入常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液，陰性對照組僅含轉(zhuǎn)染試劑終濃度為250 nmol/L的常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液，分別按實驗組相同的條件進行培養(yǎng)，并于同一時間終止培養(yǎng)。因為本實驗的RNA oligo為小分子RNA，可靶向作用于beclin 1，并使之沉默，故將其簡寫為si-beclin 1，其 具 體 序 列 為 5＇GGCACAAUCAAUAAUUUCATTUGAAAUUAUUGAUUGUGCCT 3＇。

1.4.1.2 RT-PCR儀檢測各組自噬相關(guān)基因的表達水平

取上述不同處理后的各組細胞，用RT-PCR儀分別檢測 atg-7、atg-12、beclin 1、Lc-3 mRNA 的表達水平。所有操作步驟均同實驗1.3.2。

1.4.2 抑制自噬對干性標(biāo)記基因表達影響的觀察

1.4.2.1 實驗分組和處理

取P1代小鼠BMMSCs接種于12孔板(3×105/孔)，常規(guī)培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，棄原液并將細胞隨機分為自噬抑制組(si-beclin 1組)、自噬抑制后再激活組(si-beclin 1+Rapamycin組)、正常對照組和陰性對照組，分別按實驗1.4.1.1相同的方法對各組細胞進行相應(yīng)的處理(兩實驗組用siRNA進行轉(zhuǎn)染，兩對照組用相應(yīng)的對照培養(yǎng)液培養(yǎng))后，si-beclin 1+Rapamycin組再用含雷帕霉素終濃度為20 nmol/L的α-MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組均于同一時間終止培養(yǎng)，并收集細胞進行以下檢測。

1.4.2.2 PT-PCR儀檢測各組干性標(biāo)記基因的表達水平

取上述處理結(jié)束后的各組細胞，并按實驗1.3.2相同的操作步驟提取細胞總RNA;然后用RT-PCR儀分別檢測各組細胞的干性標(biāo)記基因 Nanog、Oct-4、Sox-ⅡmRNA表達水平。所用引物同表3。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

科研成果轉(zhuǎn)化過程。包含狹義的轉(zhuǎn)化過程和廣義的轉(zhuǎn)化過程。狹義的轉(zhuǎn)化過程是專指課題研究結(jié)束成果形成后，從知識的文本報告狀態(tài)到生產(chǎn)、科研的應(yīng)用狀態(tài)的實現(xiàn)過程。而廣義轉(zhuǎn)化過程是指整個科研活動過程及成果形成后，包括研究階段的轉(zhuǎn)化、成果形成階段的轉(zhuǎn)化和二次開發(fā)轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BMMSCs原代細胞的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡觀察可見，原代培養(yǎng)的小鼠BMMSCs呈梭性或不規(guī)則的多邊形，可貼壁生長，并有若干集落形成，整體生長形態(tài)類似于漩渦狀;培養(yǎng)第10天時，細胞融合程度約為80% ～90%(圖1)。

圖1 小鼠BMMSCs原代培養(yǎng)第10天時鏡下觀察

2.2 小鼠BMMSCs表型鑒定結(jié)果

流式細胞儀檢測顯示，P3代小鼠BMMSCs中CD90.2、CD29、SCA-1的陽性率分別為 97.4%、97.6%、83.5%;CD31、CD146、CD11b 的陽性率分別為2.9%、2.4%、5.6%(圖2)。

圖2 小鼠BMMSCs表面標(biāo)記物流式細胞儀檢測結(jié)果

2.3 激活小鼠BMMSCs自噬后的觀察結(jié)果

2.3.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察

小鼠 BMMSCs經(jīng)20 nmol/L雷帕霉素刺激24 h后，生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)與對照組相比無明顯變化;未見細胞團縮、漂浮等情況(圖3)。

圖3 小鼠BMMSc經(jīng)20 nmol/L雷帕霉素刺激24 h后相差顯微鏡觀察(×20)

2.3.2 各組各自噬相關(guān)基因表達水平的比較

RT-PCR檢測顯示，小鼠BMMSCs經(jīng)20 nmol/L雷帕霉素刺激24 h后，各自噬相關(guān)基因的表達水平均較對照組有所升高;其中beclin 1、atg-7和atg12升高顯著，與對照組相比均P＜0.05，而LC-3的表達變化不大，與對照組相比P＞0.05(圖4)。

圖4 雷帕霉素刺激后BMMSCs中各自噬相關(guān)基因表達的變化

2.3.3 各組各自噬相關(guān)基因蛋白的表達水平比較

Western-blot檢測結(jié)果與RT-PCR基本一致，即實驗組的beclin 1、atg-7和atg-12蛋白的表達水平均高于對照組;而LC-3Ⅰ的表達變化不大，但LC-3Ⅱ的表達有所增加(圖5)。

圖5 雷帕霉素刺激后BMMSCs中各自噬相關(guān)基因蛋白的變化

2.3.4 各組干性標(biāo)記基因表達水平的比較

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，小鼠 BMMSCs經(jīng)20 nmol/L雷帕霉素刺激24 h后，各干性標(biāo)記基因Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ mRNA的表達水平均明顯高于對照組(P﹤0.05)，其中以Sox-Ⅱ的表達增加最為明顯(圖6)。

圖6 雷帕霉素刺激后BMMSCs中各干性標(biāo)記基因表達的變化

2.4 抑制小鼠BMMSCs自噬后的觀察結(jié)果

2.4.1 各組各自噬相關(guān)基因表達水平的比較

通過si-RNA轉(zhuǎn)染抑制小鼠BMMSCs自噬后(si-beclin 1實驗組)，各自噬相關(guān)基因的表達水平均明顯低于正常對照組和陰性對照(Negative Control，NC)組(P﹤0.05);而陰性對照組中各自噬相關(guān)基因的表達水平雖較正常對照組有所升高，但均無統(tǒng)計學(xué)差異(P﹥0.05)(圖7)。以上結(jié)果說明si-RNA轉(zhuǎn)染有效，并可以排除轉(zhuǎn)染試劑可能帶來的干擾。

圖7 si-beclin 1轉(zhuǎn)染后BMMSCs中各自噬相關(guān)基因表達的變化

2.4.2 各組各干性標(biāo)記基因表達水平的比較

通過si-beclin 1轉(zhuǎn)染實驗抑制小鼠BMMSCs自噬后，各干性標(biāo)記基因Nanog、Oct-4和Sox-ⅡmRNA的表達水平均明顯低于正常對照組和陰性對照組(P﹤0.05);用雷帕霉素對si-beclin 1轉(zhuǎn)染后的小鼠BMMSCs進行刺激，則可使各干性標(biāo)記基因Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ mRNA的表達水平有所回升，但是除Nanog恢復(fù)到正常對照組的水平(P﹥0.05)外，其他各基因仍明顯低于兩對照組(P﹤0.05)(圖8)。

圖8 si-beclin 1轉(zhuǎn)染后BMMSCs中各干性標(biāo)記基因表達的變化

3 討論

基于間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的多向分化潛能，各種組織來源的MSCs都可以作為組織工程的種子細胞［11］，特別是骨髓來源的MSCs，因其取材簡單，來源豐富，且具有較好地免疫原性［12］，而受到廣泛地關(guān)注，臨床應(yīng)用前景非常廣闊。但是，如何使BMMSCs在體外或宿主體內(nèi)保持良好的細胞干性和相對健康的生長狀態(tài)，目前所能做的還很有限。當(dāng)下組織工程血管化的問題還沒有得到很好地解決，在血管還未長入的前期移植階段，氧和營養(yǎng)物質(zhì)不能通過血管輸送到內(nèi)部區(qū)域，而且細胞代謝產(chǎn)生的廢物也不能有效地通過血管向外排送，位于支架內(nèi)部的種子細胞如何應(yīng)對這樣的不利處境，是橫亙在組織工程和再生醫(yī)學(xué)發(fā)展道路上的一道難題［13］。

但是在一些惡性腫瘤中，由于癌細胞瘋狂生長，血管內(nèi)皮細胞不能及時在內(nèi)部實質(zhì)中形成微血管網(wǎng)絡(luò)，這時的腫瘤內(nèi)部細胞也同樣處于營養(yǎng)物質(zhì)和氧缺乏、代謝廢物累積的不利處境，雖然也有壞死灶的形成，但是最終并不妨礙瘤體的不斷生長［14］。針對上述現(xiàn)象進行研究發(fā)現(xiàn)，這些癌細胞都有著較高的自噬水平［15-16］。有鑒于此，本實驗希望夠通過激活BMMSCs的自噬來增進細胞的穩(wěn)態(tài)、促使細胞“年輕化”，提高細胞在逆境中的存活能力;并通過這一手段來維持細胞干性，支持細胞的自我更新和分化潛能。

本實驗所培養(yǎng)的小鼠BMMSCs經(jīng)表型鑒定結(jié)果顯示，CD31、CD146和CD11b等陰性標(biāo)記物表達很低，而相應(yīng)的CD90.2、CD29和SCA-1等陽性指標(biāo)均呈陽性表達［17］;結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和貼壁生長特性［18］，提示其均有較高純度和多向分化潛能。

雷帕霉素是目前較為公認的自噬激活劑［19］，本實驗以20 nmol/L的濃度作用于小鼠BMMSCs 24 h，對細胞的形態(tài)和生長均未產(chǎn)生明顯的影響。采用si-beclin 1靶向作用于beclin 1，并使之沉默，則可抑制BMMSCs的自噬活性，從方法上來說更具有專一性和安全性，且避免了不必要的干擾。

RT-PCR和 Western blot檢測結(jié)果顯示，用20 nmol/L的雷帕霉素刺激BMMSCs后，除Lc-3無明顯變化外，其他各自噬相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達水平較對照組均有所升高。雖然Lc-3變化不明顯，但實驗組中Lc-3Ⅱ的表達則有所上升，而這種蛋白水平的Lc-3Ⅰ向Lc-3Ⅱ的轉(zhuǎn)化正是自噬啟動的標(biāo)志之一，而這個過程是不涉及Lc-3基因水平表達的［20］。si-beclin 1的沉默結(jié)果也比較理想，陰性對照組中各自噬相關(guān)基因的表達水平雖較正常對照組略有上升，但差異并不顯著，從而排除了轉(zhuǎn)染試劑可能帶來的干擾。實驗組與正常對照組和陰性對照組相比，各干性標(biāo)記基因Nanog、Oct-4和Sox-ⅡmRNA的表達水平均明顯下降，從基因水平上看達到了抑制BMMSCs自噬水平的目的。

本結(jié)果表明，小鼠BMMSCs的自噬水平與細胞干性標(biāo)記基因之間存在著密切的聯(lián)系，當(dāng)BMMSCs的自噬水平發(fā)生變化后，Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ各干性標(biāo)記基因也隨之發(fā)生了同步的變化，特別是Sox-Ⅱ升高更明顯。當(dāng)si-beclin 1抑制了小鼠BMMSCs的自噬活性之后，Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ的表達也同步下調(diào);而再用雷帕霉素部分恢復(fù)受si-beclin 1抑制的自噬活性時，其干性標(biāo)記基因的表達也有了明顯的回升。以上結(jié)果提示，在一定范圍內(nèi)，激活BMMSCs的自噬可以有效提高干性標(biāo)記基因的表達，但其具體機制還有待進一步的探索。

［1］Hanjaya-Putra D，Shen YI，Wilson A，et al.Integration and regression of implanted engineered human vascular networks during deep wound healing［J］.Stem Cells Transl Med，2013，2(4):297-306.

［2］Boeckel DG，Shinkai RS，Grossi ML，et al.Cell culture-based tissue engineering as an alternative to bone grafts in implant dentistry:a literature review［J］.J Oral Implantol，2012，38(1):538-545.

［3］Kim J，Kim HN，Lim KT，et al.Designing nanotopographical density of extracellular matrix for controlled morphology and function of human mesenchymal stem cells［J］.Sci Rep，2013，19(3):35-52.

［4］Liu Y，Wang L，Kikuiri T，et al.Mesenchymal stem cell-based tissue regeneration is governed by recipient T lymphocytes via IFN-gamma and TNF-alpha［J］.Nat Med，2011，17(12):1594-1601.

［5］Li X，Li L，Pandey R，et al.The histone acetyltransferase MOF is a key regulator of the embryonic stem cell core transcriptional network［J］.Cell Stem Cell，2012，11(2):163-178.

［6］Mikelsaar AV，Sunter A，Mikelsaar R，et al.Epitope of titin A-band-specific monoclonal antibody Tit1 5 H1.1 is highly conserved in several Fn3 domains of the titin molecule.Centriole staining in human，mouse and zebrafish cells［J］.Cell Div，2012，7(1):21.

［7］Rajawat YS，Hilioti Z，Bossis I.Aging:central role for autophagy and the lysosomal degradative system［J］.Ageing Res Rev，2009，8(3):199-213.

［8］Zhang Q，Yang YJ，Wang H，et al.Autophagy activation:a novel mechanism of atorvastatin to protect mesenchymal stem cells from hypoxia and serum deprivation via AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin pathway［J］.Stem Cells Dev，2012，21(8):1321-1332.

［9］Madeo F，Tavernarakis N，Kroemer G.Can autophagy promote longevity［J］.Nat Cell Biol，2010，12(9):842-846.

［10］周穎，高孟飛，朱慧勇.間充質(zhì)干細胞干性維持信號通路的研究進展［J］.吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2013，39(3):638-642.

［11］Lee SK，Kim Y，Kim SS，et al.Differential expression of cell surface proteins in human bone marrow mesenchymal stem cells cultured with or without basic fibroblast growth factor containing medium［J］.Proteomics，2009，9(18):4389-4405.

［12］Bianco P，Robey PG，Simmons PJ.Mesenchymal stem cells:revisiting history，concepts，and assays［J］.Cell Stem Cell，2008，2(4):313-319.

［13］Novosel EC，Kleinhans C，Kluger PJ.Vascularization is the key challenge in tissue engineering［J］.Adv Drug Deliv Rev，2011，63(4-5):300-311.

［14］Kakkad SM，Penet MF，Akhbardeh A，et al.Hypoxic tumor environments exhibit disrupted collagen I fibers and low macromolecular transport［J］.PLoS One，2013，8(12):81869.

［15］Wirawan E，Vanden BT，Lippens S，et al.Autophagy:for better or for worse［J］.Cell Res，2012，22(1):43-61.

［16］Li LC，Liu GD，Zhang XJ，et al.Autophagy，a novel target for chemotherapeutic intervention of thyroid cancer［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2013，73(3):439-449.

［17］Tropel P，Noel D，Platet N，et al.Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow［J］.Exp Cell Res，2004，295(2):395-406.

［18］Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement［J］.Cytotherapy，2006，8(4):315-317.

［19］Klionsky DJ，Abdalla FC，Abeliovich H，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy［J］.Autophagy，2012，8(4):445-544.

［20］Lipinski MM，Hoffman G，Ng A，et al.A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions［J］.Dev Cell，2010，18(6):1041-1052.