羅傲翔，吳補(bǔ)領(lǐng)，侯 晉，吳靖漪，胡 嬌，李心竹

(廣東廣州:1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，510515;3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省口腔醫(yī)院，510280)

牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是存在于牙周組織中的干細(xì)胞，由Seo等［1］2004年首次從健康成年人牙周膜組織中分離，并發(fā)現(xiàn)其具有成體干細(xì)胞的特性，可作為牙周組織再生的種子細(xì)胞。但常規(guī)貼壁培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞會隨著體外培養(yǎng)時間的延長，而漸漸喪失間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化特性。有研究發(fā)現(xiàn)，3D培養(yǎng)的細(xì)胞具備更好的細(xì)胞表型，更接近人體三維組織結(jié)構(gòu);并因其可最大程度地維持細(xì)胞的性狀而備受組織工程研究的關(guān)注［2］?，F(xiàn)行的3D細(xì)胞培養(yǎng)方法有:多孔細(xì)胞支架培養(yǎng)［3］、動力培養(yǎng)系統(tǒng)(包括旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞反應(yīng)器和攪拌式反應(yīng)器)以及微基板的3D培養(yǎng)法。懸滴培養(yǎng)法(hanging drop)也是3D培養(yǎng)方法的一種，且其因操作簡便，無需運(yùn)用特殊儀器而受到廣大研究者的推崇。目前，尚未對懸滴法3D培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞的生物表型及其生物特性進(jìn)行專門探討，因此，本實(shí)驗(yàn)擬運(yùn)用懸滴法3D培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞，并通過觀察3D牙周膜干細(xì)胞聚合物在體外的形態(tài)、細(xì)胞的存活率、細(xì)胞表面標(biāo)記物以及細(xì)胞礦化能力的改變，對懸滴法培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行初步的研究，以期為牙周組織再生奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國);Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶(Gibco，美國);Hanging Drop培養(yǎng)板(Perfecta3D Hanging Drop Plates 3D，美國);培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板(Corning Costar，美國);Mxpro-Mx7500熒光定量 PCR儀(Stratagene，美國);智能激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV10i-W型，日本);倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本);流式細(xì)胞儀(BD，美國);碘化丙啶(Propidium Iodide，PI);鈣黃綠素(Calcein-AM)(Sigma，美國);RNeasy Mini Kit(Qiagen，德國);CD44、CD29、CD90、CD105熒光素標(biāo)記鼠抗人抗體(biolegend，美國)。

1.2 PDLSCs的分離培養(yǎng)

收集18～25歲志愿者(知情同意)因正畸減數(shù)而新鮮拔除的無齲損、無牙周病的前磨牙或第三磨牙，用含雙抗的PBS反復(fù)沖洗后，刮取根中1/3牙周膜并將其剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小的組織塊;用Ⅰ型膠原(625 U/mL)37℃消化10 min使組織松散后，1 000 r/min離心5 min，棄上清;加入少量DMEM培養(yǎng)液并輕輕吹打，使細(xì)胞懸液與松散的組織呈混勻狀態(tài)后，將其移至6孔板內(nèi)鋪平，并用蓋玻片壓于組織之上;分別于每孔加入2 mL培養(yǎng)液，放入37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3 d后半量換液，此后隔天換液，待細(xì)胞生長至80%融合時，常規(guī)傳代培養(yǎng)［4］。

1.3 3D PDLSCs培養(yǎng)

取第3代PDLSCs，根據(jù)文獻(xiàn)報道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按接種細(xì)胞數(shù)量不同分為3組:2.5×104組、5×104組、1×105組。然后將3組細(xì)胞分別接種于Perfecta3D Hanging Drop Plates 3D培養(yǎng)板中，常規(guī)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每天換液1次，96 h后收取各組細(xì)胞聚合物進(jìn)行以下相關(guān)檢測。

1.4 不同密度PDLSCs 3D培養(yǎng)時的細(xì)胞活性檢測

取2D培養(yǎng)(傳代貼壁高密度)的PDLSCs及不同細(xì)胞接種量(2.5×104/孔，5×104/孔、1×105/孔)下3D培養(yǎng)的PDLSCs細(xì)胞聚合物，倒置顯微鏡下觀察并測量其直徑后，分別于各孔中加入PI/Calcein-AM混合熒光染色液(PI終濃度為15 μmol/L，Calcein-AM 終濃度為10 μmol/L)，放入孵箱中孵育24 h后熒光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 2D和3D培養(yǎng)的PDLSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測

分別取第3代貼壁培養(yǎng)(2D)的PDLSCs和細(xì)胞接種密度為2.5×104/孔的3D培養(yǎng)的 PDLSCs聚合物，用胰蛋白酶消化并制備單細(xì)胞懸液后，分別加入 PE或 FITC標(biāo)記的 CD44、CD29、CD90、CD105鼠抗人抗體，流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記抗體陽性細(xì)胞的百分比。

1.6 2D和3D培養(yǎng)的PDLSCs礦化分化能力觀察

1.6.1 礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)

取第3代PDLSCs以2.5×104/孔的密度分別接種于24孔板(2D培養(yǎng))及hanging drop 3D培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)96 h后棄原培養(yǎng)液，2D培養(yǎng)的24孔板中直接加入礦化誘導(dǎo)液(含100 mL/L FBS、0.1 μmol/L 塞 米 松、50 μmol/L 維 他 命 C、10 mmol/L B-磷酸甘油的 DMEM)繼續(xù)培養(yǎng);hanging drop 3D培養(yǎng)板中的PDLSCs先移入低粘附6孔板后，再加入礦化誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6.2 茜素紅染色觀察

2D、3D培養(yǎng)的PDLSCs分別經(jīng)礦化誘導(dǎo)7 d后，用茜素紅進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并拍照。

1.6.3 礦化相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測

2D和3D培養(yǎng)的PDLSCs經(jīng)礦化誘導(dǎo)7 d后，分別用RNeasy Mini Kit提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Genbank查得骨橋蛋白(OPN)、堿性磷酸酶(ALP)和GAPDH的基因序列分別為NM000582.2、NM001127501.2和NM002046.4后，運(yùn)用Oliga 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并由上海生工生物工程有限公司合成(具體序列見表1)。然后用熒光定量PCR(qRT-PCR)儀分別檢測2D、3D培養(yǎng)的PDLSCs中OPN、ALP RQ mRNA的水平，并使用儀器自帶軟件對其結(jié)果進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞活性分析

2.1.1 原代PDLSCs

改良酶消化組織塊法培養(yǎng)7 d后，既有細(xì)胞從組織塊中游出;細(xì)胞呈長梭形，胞質(zhì)均勻，胞體豐滿，胞核橢圓，胞質(zhì)突起呈放射狀，呈成纖維細(xì)胞樣(圖1)。

2.1.2 不同細(xì)胞量3D培養(yǎng)的PDLSCs聚合物

PDLSCs 3D培養(yǎng)96 h后，即形成一均質(zhì)而致密的3D細(xì)胞聚集體，其致密程度與細(xì)胞初始接種數(shù)量呈正相關(guān)。細(xì)胞量為2.5×104/孔的細(xì)胞聚合物直徑約為(0.73±0.14)mm;細(xì)胞量為5×104/孔的細(xì)胞聚合物直徑約為(0.94±0.3)mm;細(xì)胞量為1×105/孔的細(xì)胞聚合物直徑約為(1.24±0.23)mm(圖2)。

圖1 原代培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞(倒置顯微鏡，×10)

圖2 不同細(xì)胞量3D培養(yǎng)的PDLSCs細(xì)胞聚合物直徑(倒置顯微鏡×10，bar=100 μm)

2.1.3 不同密度PDLSCs 3D培養(yǎng)時細(xì)胞活性比較

3D及2D培養(yǎng)96 h后的PDLSCs聚合物經(jīng)Live/Dead染色激光共聚焦顯微鏡觀察可見，3D培養(yǎng)情況下，接種細(xì)胞數(shù)量為2.5×104時，細(xì)胞存活率較高，聚合物中心未見明顯的壞死現(xiàn)象(圖3a);接種細(xì)胞數(shù)量為5×104時，細(xì)胞存活率雖有所降低，但活細(xì)胞數(shù)目仍然較多(圖3b);當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)為1×105時，細(xì)胞存活率低且聚合物中心壞死明顯(圖3c);而2D的PDLSCs未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壞死現(xiàn)象(圖3d)。因此選擇2.5×104的細(xì)胞接種量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 干細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，第3代PDLSCs(2D培養(yǎng))均陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD29、CD90、CD105，其陽性率分別為 99.13%、98.17%、100%、78.21%;2.5×104/孔的接種密度3D培養(yǎng)的PDLSCs亦陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD44、CD29、CD90、CD105，其陽性率分別為 99.58%、88.19%、99.51%、51.25%(圖 4)。

圖3 2D、3D培養(yǎng)96 h后的PDLCs聚合物L(fēng)ive/Dead染色觀察(共聚焦顯微鏡×20)

圖4 2D、3D培養(yǎng)的PDLSCs干細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.3 3D和2D培養(yǎng)的PDLSCs礦化分化能力比較

2.3.1 礦化結(jié)節(jié)形成情況比較

2D和3D培養(yǎng)的PDLSCs礦化誘導(dǎo)7 d后，茜素紅染色顯示:2D培養(yǎng)的PDLSCs僅可見少數(shù)紅色礦化結(jié)節(jié)，而2.5×104/孔細(xì)胞密度3D培養(yǎng)的PDLSCs則可見大量的茜素紅陽性染色物質(zhì)(圖5)。

圖5 2D、3D培養(yǎng)的 PDLSCs礦化誘導(dǎo)7 d后茜素紅染色觀察(倒置顯微鏡 ×10)

2.3.2 礦化相關(guān)基因表達(dá)水平的比較

2D和3D培養(yǎng)的PDLSCs礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，熒光實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示，3D培養(yǎng)的PDLSCs各礦化相關(guān)基因ALP及OPN mRNA的表達(dá)水平(RQ值)均明顯高于2D培養(yǎng)的PDLSCs(P＜0.05)，表明3D培養(yǎng)有利于PDLSCs的礦化向分化(圖6)。

圖62 D、3D培養(yǎng)的PDLSCs各礦化相關(guān)基因表達(dá)水平的比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用懸滴法3D培養(yǎng)PDLSCs，觀察到PDLSCs可聚合成3D細(xì)胞聚合物。與其他3D培養(yǎng)方法(如微基板、生物反應(yīng)器、支架材料等)相比，懸滴法操作簡便，并且可使細(xì)胞緊密聚合，從而促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用，提高干細(xì)胞的生物學(xué)特性。Bartosh TJ等(2010)使用懸滴法3D培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示該方法培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞克隆形成能力及分泌抗炎因子能力均顯著增強(qiáng)，并且仍保持其多向分化的潛能［5］。PDLSCs是牙周組織再生的重要的種子細(xì)胞，具有取材方便、獲得率高、增殖能力強(qiáng)等優(yōu)勢，并且在體外特定培養(yǎng)條件下，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞;在體內(nèi)可生成牙骨質(zhì)樣組織和牙周膜樣組織，具有牙周再生的潛能。因此PDLSCs近年來已成為口腔組織工程種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)之一［6］。另外，通過3D法培養(yǎng)PDLSCs可以大量獲得種子細(xì)胞并可提高其生物學(xué)特性，因此，懸滴法3D培養(yǎng)PDLSCs在牙周組織再生修復(fù)中具有一定的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HangingDrop 96孔3D培養(yǎng)板對PDLSCs進(jìn)行3D培養(yǎng)后，Live/Dead染色觀察顯示:當(dāng)接種細(xì)胞的密度為2.5×104/孔時，細(xì)胞活性較好;而當(dāng)細(xì)胞接種數(shù)量為5×104/孔或1×105/孔時，細(xì)胞存活率則相對降低，說明3D細(xì)胞聚合物的死亡率與初始接種細(xì)胞的數(shù)目及細(xì)胞聚合體的直徑相關(guān)。初始接種5×104/孔和1×105/孔的PDLSCs可能由于細(xì)胞聚合體的直徑過大，使得營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣不能到達(dá)細(xì)胞聚合物的中心［5］，從而導(dǎo)致其中心的細(xì)胞死亡率增高;而且96孔的Perfecta3D Hanging Drop Plates每孔只能接種40～60 μL的培養(yǎng)基，不足以供給5×104～1×105/孔細(xì)胞充足養(yǎng)分。

流式細(xì)胞術(shù)檢測間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果顯示，PDLSCs均陽性表達(dá) CD29、CD44、CD90、CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物，說明所獲得的細(xì)胞為間充質(zhì)來源，且具有克隆化生長和誘導(dǎo)分化的潛能［7］。PDLSCs經(jīng)過3D培養(yǎng)后，仍表達(dá)以上標(biāo)記物，雖然某些標(biāo)記物如CD29、CD105的表達(dá)水平有所下降，但總體來說，其表達(dá)仍為陽性。這些間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物陽性表達(dá)率下降可能是由于經(jīng)過3D培養(yǎng)后，單個細(xì)胞體積變小，細(xì)胞表面積相對減少，從而影響檢測的陽性率，且細(xì)胞間相互緊密三維排列而不是貼附于培養(yǎng)皿的表面，可能使表面標(biāo)記物的表達(dá)產(chǎn)生輕微變化［8］。

Wang W等(2009)使用微基板3D培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，3D培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞礦化分化效率顯著高于2D培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［9］。但目前尚未有對懸滴法3D培養(yǎng)的PDLSCs礦化分化影響的研究報道。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用常規(guī)礦化誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)懸滴法3D培養(yǎng)的PDLSCs細(xì)胞聚合物，從茜素紅染色可見，礦化誘導(dǎo)7 d后，3D培養(yǎng)的PDLSCs細(xì)胞聚合物內(nèi)有大量的礦化沉積物，其礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)目顯著高于常規(guī)貼壁培養(yǎng)(2D)的PDLSCs;熒光實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示，3D培養(yǎng)的PDLSCs經(jīng)礦化誘導(dǎo)7 d后，其礦化相關(guān)基因ALP和OPN mRNA的表達(dá)水平均明顯高于2D培養(yǎng)的PDLSCs(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，3D培養(yǎng)的PDLSCs的礦化分化能力要優(yōu)于2D貼壁培養(yǎng)的 PDLSCs。這可能是因?yàn)?D培養(yǎng)的PDLSCs細(xì)胞排列更加緊密，并使細(xì)胞間的微環(huán)境發(fā)生改變，從而使干細(xì)胞表面膜分子間的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)發(fā)生變化，而促進(jìn)了PDLSC的分化［9-10］。Jing W 等(2010)研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞礦化分化過程中notch通路的激活可以促進(jìn)其礦化分化［11］，而wnt信號通路也在骨的發(fā)生發(fā)展上起重要的作用［12］。因此，在以后實(shí)驗(yàn)中還需進(jìn)一步探究notch信號通路和wnt信號通路在3D培養(yǎng)的PDLSCs上的改變。

綜上所述，應(yīng)用HangingDrop 96孔培養(yǎng)板3D培養(yǎng)的PDLSCs，當(dāng)細(xì)胞接種數(shù)量為2.5×104/孔時，細(xì)胞聚合物中的細(xì)胞能保持較高的生存活性，并能顯著促進(jìn)其礦化分化的能力。提示，3D懸滴培養(yǎng)法是一種較理想的細(xì)胞培養(yǎng)方法。隨著口腔組織工程研究的進(jìn)一步深入，3D培養(yǎng)PDLSCs以大量獲得種子細(xì)胞并且提高種子細(xì)胞的多向分化潛能將會是一項(xiàng)重要的研究，為實(shí)現(xiàn)完全性和功能性的牙周組織再生、為探索新型的牙周病治療手段提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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