李 陳，牛翠娟

(生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室，北京師范大學生命科學學院，北京 100875)

化學信號是水生生物信號傳遞的主要手段之一[1]。水體中的各種化學信號以及代謝產物對水生動物捕食和逃避捕食者，種群間與種群內個體間的競爭，防止種群過量增長等都具有重要影響，構成水生態(tài)系統(tǒng)化學生態(tài)學的主要研究內容[2]。輪蟲作為化學生態(tài)學主要研究對象之一已經有較多的相關研究，如捕食者信號介導的誘導防御[3- 5]，枝角類和輪蟲釋放的某些化學信號可抑制其自身的生長和繁殖[6- 8]，同種的密度信號誘導輪蟲發(fā)生的有性生殖[9- 10]。除密度信號誘導的有性生殖和自毒作用[11]外，關于輪蟲自身釋放的化學物質對種間關系影響的研究比較少[12]。

萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)和角突臂尾輪蟲(Brachionusangularis)是廣泛分布于淡水水域的兩種常見的營浮游生活的臂尾輪蟲，親緣關系近，且同域分布。有關這兩個物種之間的競爭，由于小個體的角突臂尾輪蟲生長繁殖所需食物閾濃度更低[13]，根據Tilman的資源競爭法則[14]，在有限食物資源的情況下，角突臂尾輪蟲最終會將萼花臂尾輪蟲排除。但是在許多競爭實驗中觀察到，即使在食物很充足還未發(fā)生資源競爭的情況下，某些輪蟲的種群增長也會受到競爭者的干擾[15- 17]，因此我們推測在輪蟲的種間競爭中除了資源競爭之外，必定還存在其他方式的干擾。目前對于化學性干擾所起的作用研究資料較少。本研究擬通過實驗檢測萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲的密度信號分別對同種和異種種群增長的影響，觀察不同物種對密度信號的響應情況。由于預實驗過程中發(fā)現萼花臂尾輪蟲種群增長受自身密度信號抑制較明顯，為探討原因，在觀測密度信號對萼花臂尾輪蟲種群增長的實驗中同時觀測密度信號對萼花臂尾輪蟲種群混交率的影響。本研究成果可為評價化學性干擾在種間競爭中的作用，以及深入了解單巢類輪蟲的競爭機制提供依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗輪蟲種群的培養(yǎng)和種群密度信號的制備

餌料藻的培養(yǎng): 本實驗飼養(yǎng)輪蟲所用餌料為蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫。在溫度25 ℃，光照3000 lx，光照時間L∶D=16∶8的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用前將處于指數增長期的藻液在4 ℃、7500 r/min離心5 min，將收集的濃縮藻液計數并置于4 ℃冰箱內備用。

輪蟲的培養(yǎng): 本研究所用的萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲均采自北京市西海，在實驗室挑選單只輪蟲進行單克隆培養(yǎng)，采用Modified MBL培養(yǎng)液[18](pH值 7.5)在恒溫光照培養(yǎng)箱(20 ℃，2000 lx光照，L∶D=16∶8)進行培養(yǎng)。整個實驗期間的食物濃度均為1×106個/mL，每天更換1次培養(yǎng)液，萼花臂尾輪蟲預培養(yǎng)種群密度維持在1 個/mL左右，角突臂尾輪蟲種群密度維持在2 個/mL左右，均進行一個月以上的預培養(yǎng)。

密度信號的制備: 實驗中分別用不同密度的萼花臂尾輪蟲濾液和角突臂尾輪蟲濾液來代表不同強度的密度信號。根據預實驗的種群增長情況，每種輪蟲設置兩個密度信號強度，角突臂尾輪蟲低密度信號和高密度信號分別表示為AL和AH，萼花臂尾輪蟲低密度信號和高密度信號分別表示為CL和CH。觀測密度信號對萼花臂尾輪蟲種群增長影響的實驗所采用的密度信號分別為：角突臂尾輪蟲AL(10 個/mL)和AH(40 個/mL)，萼花臂尾輪蟲CL(4個/mL)和CH(16 個/mL)。觀測密度信號對角突臂尾輪蟲種群增長影響的實驗所采用的密度信號為AL(25 個/mL)和AH(100 個/mL)，CL(4個/mL)和CH(16 個/mL)。為了描述和比較的方便，采用相同的字母標簽。按照設定的密度隨機挑選對應數量的萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲，分別置于對應體積加有食物的培養(yǎng)液中，24h后用50 μm紗絹過濾除掉輪蟲，然后再用0.22 μm微孔濾膜過濾，用0.1 mol/L的HCl/NaOH溶液將培養(yǎng)液pH值調至7.5后備用。對照組(Control)用未經處理的培養(yǎng)液(pH值 7.5)。

1.2 實驗過程

根據萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲種群增長的特點，分別采用20 mL和5 mL的培養(yǎng)體積，初始接種密度均為1 個/mL。從預培養(yǎng)種群中隨機挑選對應數量的輪蟲個體，將每種輪蟲分別劃分到5種不同培養(yǎng)液的實驗組中(空白對照組+4種含不同密度信號濾液組)，每組實驗4個重復，食物濃度均為1×106個/mL。每天更換對應含1×106個/mL食物的培養(yǎng)液并記數，萼花臂尾輪蟲種群分別記錄帶非混交卵雌體數(amictic females，AF)、未帶卵雌體數(non-ovigerous females，NOF)、帶混交卵雌體數(mictic females，MF)。由于角突臂尾輪蟲受自身密度信號的影響不明顯，故不做有性生殖分析，僅記錄種群個體數量變化。實驗直到種群密度經過最高點后達到平穩(wěn)時期時(種群密度連續(xù)3d變化幅度低于15%)停止。

1.3 結果分析方法

1.3.1 種群增長結果分析

選取種群密度至平穩(wěn)期之前的數據，用IBM SPSS Statistic 21.0 中一般線性模型的重復測量分析方法分析密度信號對種群增長的影響[19]。

利用Origin Pro. 8.0中的擬合分析對增長期的種群增長進行邏輯斯諦生長曲線擬合，所用擬合公式可表示為：

式中,K為環(huán)境容納量，r為種群增長率，t為時間，獲得K,a,r的估計值以及修正后的R2。

為了更好的比較種群的增長率，選取種群峰值密度及到達峰值所用的時間，利用公式來計算增長期的種群增長率rm:

rm=(lnNt-lnN0)/t

式中,N0和Nt分別為種群的初始密度和最終密度，t為種群增長經歷的時間(d)[20]，用one way-ANOVA統(tǒng)計分析各實驗組間rm的差異。

1.3.2萼花臂尾輪蟲種群混交率(即有性生殖比率)結果分析

混交率(mixis)為混交個體數與雌體總數之比，由于種群中部分未成熟的個體無法判定其為混交或非混交雌體，故無法直接獲得精確的混交率。假設種群中未帶卵的雌體的混交率與種群的混交率相同且忽略密度信號對帶卵率的影響，則m=MF/(AF+MF)[21]，繪制種群的混交率變化曲線，去除異常值后用IBM SPSS Statistic 21.0 中一般線性模型的重復測量分析方法分析密度信號對種群混交率的影響。

2 結果與分析

2.1 不同實驗處理下萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲種群增長分析

不同實驗組萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲的種群密度變化如圖1所示。萼花臂尾輪蟲種群到達種群密度最高點的時間很短(3—8 d)，其中對照組和角突臂尾輪蟲密度信號處理組(AL和AH)密度峰值達10 個/mL左右，而萼花臂尾輪蟲密度信號處理組(CL和CH)密度峰值僅4 個/mL左右，不到前者的一半，隨后種群密度開始持續(xù)降低。CH組的萼花臂尾輪蟲種群在15 d左右的時候消失。

角突臂尾輪蟲種群種群增長期歷時23 d左右，對照組和角突臂尾輪蟲密度信號組最高種群密度為100 個/mL左右，隨后種群密度開始下降，然后進入一個動態(tài)平穩(wěn)的時期(27—32 d)。

用一般線性模型的重復測量分析方法對種群進行分析的結果顯示，兩種臂尾輪蟲的種群增長都顯著受密度信號的影響(B.calyciflorus：P<0.001，B.angularis：P=0.018)。

邏輯斯諦模型擬合生長曲線獲得K,a,r的估計值及修正后的R2如表1所示，擬合的種群增長曲線如圖2和圖3所示。

統(tǒng)計分析結果顯示，角突臂尾輪蟲密度信號組(AL和AH)的萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲種群的環(huán)境容納量K均與對照組無顯著差異(表1)，分別在9 個/mL左右和100 個/mL左右。萼花臂尾輪蟲密度信號使萼花臂尾輪蟲種群的環(huán)境容納量K降低了50%—62%，使角突臂尾輪蟲的種群K值降低了29%—40%。萼花臂尾輪蟲低密度信號(CL)對萼花臂尾輪蟲種群的增長率r影響顯著，高密度信號組(CH)未檢測出對萼花臂尾輪蟲種群增長率的顯著影響。CH組的角突臂尾輪蟲種群增長率r顯著高于對照組，角突臂尾輪蟲密度信號對萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲種群的種群增長率影響均不顯著。

圖1 萼花臂尾輪蟲(a)和角突臂尾輪蟲(b)的種群增長

表1 logistic模型擬合生長曲線參數(Value±SE，*表示與對照組之間具有顯著的差異，α=0.05)

各實驗組種群增長期的種群增長率rm計算及分析結果如圖4所示。

根據峰值計算的rm值的變化情況與曲線擬合的r變化趨勢大體相似，角突臂尾輪蟲的密度信號對兩種臂尾輪蟲的種群增長率均沒有顯著的影響(P>0.05)。萼花臂尾輪蟲高密度信號(CH)下的萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲的rm均顯著高于對照組(P<0.001)，萼花臂尾輪蟲低密度信號(CL)僅對萼花臂尾輪蟲的種群增長率有顯著影響(P<0.001)。

圖2 不同密度信號下的萼花臂尾輪蟲種群動態(tài)(符號)及l(fā)ogistic增長模型(線)

圖3 不同密度信號下的角突臂尾輪蟲種群動態(tài)(符號)及l(fā)ogistic增長模型(線)

圖4 不同密度信號下萼花臂尾輪蟲(a)和角突臂尾輪蟲(b)的種群增長率(rm)(Mean±SE)

2.2 密度信號對萼花臂尾輪蟲種群有性繁殖的影響

不同實驗組萼花臂尾輪蟲種群的混交率隨時間的變化情況如圖5所示。

圖5 不同實驗組萼花臂尾輪蟲種群混交率隨時間的變化

重復測量分析方法對混交率進行分析的結果顯示，密度信號對各實驗組萼花臂尾輪蟲種群的混交率無顯著影響(P=0.25)。

種群的混交率在40%—80%之間波動，在各實驗組之間無法看出很明顯的差異。各實驗組最早均在第4天出現休眠卵。

3 討論

根據實驗結果，萼花臂尾輪蟲密度信號對角突臂尾輪蟲和萼花臂尾輪蟲的種群增長都有顯著的影響，可提高種群增長率rm，降低環(huán)境容納量K。而角突臂尾輪蟲密度信號對于角突臂尾輪蟲種群和萼花臂尾輪蟲種群增長影響都不顯著。萼花臂尾輪蟲種群的混交率在各實驗組之間也無顯著差異。

在實驗室種群動態(tài)中，除食物資源起主要限制作用外，影響種群密度的因子大概有3個：(1)密度信號誘導的有性生殖[22]，(2)生物釋放的某些有益的化學因子[12]，(3)代謝廢物的毒害作用[11]。

密度信號中含有可以誘導輪蟲進行密度相關的有性生殖的物質，有性生殖最終會產生比無性卵需要更多能量投入的休眠卵[23]，對種群的適合度產生代價，使種群的K值降低[22]。但是密度信號在不同的物種之間是具有特異性的[24]，萼花臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲之間不能相互誘導有性生殖的發(fā)生，雖然有發(fā)現大于100 個/mL密度的角突臂尾輪蟲濾液可以使萼花臂尾輪蟲發(fā)生有性生殖[25]，但本實驗中用于萼花臂尾輪蟲種群實驗的角突臂尾輪蟲密度信號低于100 個/mL，因此本實驗中臂尾輪蟲種群受非同種臂尾輪蟲的密度信號產生的差異不是由有性生殖造成的。對于同種密度信號對種群的作用，種群混交率隨著種群增長率的提高而增加[26]，但是種群在達到一定的密度之后，有性生殖的投入是有限的，再高的密度信號也不可能誘導100%的混交率[27]，混交率在種群達到一定密度之后會維持在一個比較穩(wěn)定的水平，對同一個克隆，有性生殖閾密度是一定的，因此各實驗組之間的混交率不會出現較大的差異。本研究中萼花臂尾輪蟲種群的混交率在各實驗組之間均無顯著的差異，與上述推斷相符，因此在本實驗中展現的同種密度信號的抑制效果的差異不是由有性生殖造成的。

密度信號中含有的某些代謝物質可能會對輪蟲產生影響，本實驗中萼花臂尾輪蟲的密度信號提高了萼花臂尾輪蟲的種群增長率r，這與Yoshinaga等[12]利用褶皺臂尾輪蟲進行生命表實驗得到的研究結果相似，褶皺臂尾輪蟲濾液使同種個體的發(fā)育時間縮短，初次性成熟年齡提前，初次性成熟時的體型變小，從而使種群增長率提高。本研究雖然是從種群增長角度做的觀測，但得到的密度信號使種群增長率提高的結果相似。在水蚤種群中也有類似的發(fā)現。水蚤密度信號對幼體生長發(fā)育影響顯著，大型蚤(Daphniamagna)的生長速率、初次性成熟的體長和產卵量都隨著同種濾液密度的升高而增加，透明溞(Daphniahyalina)的體長則呈現出隨濾液密度先增加后降低的趨勢[28]。本實驗中，萼花臂尾輪蟲的密度信號使角突臂尾輪蟲的種群增長率提高，環(huán)境容納量K降低，所以輪蟲的種間競爭除了資源競爭之外，應該還存在化學性干擾的作用。

輪蟲的自毒作用(auto toxicity)是指輪蟲釋放的對自身有毒害作用的化學物質，可以降低個體存活率。Kirk[11]證實了由化學物質誘導的自毒作用對實驗室梳狀疣毛輪蟲(Synchaetapectinata)種群的調節(jié)。萼花臂尾輪蟲的進食率和同化率均會受自毒作用而降低[29]。類似的自毒物質對實驗室種群的抑制效果在水蚤中也有發(fā)現，而且所需的密度較低，約40—150 個/L的密度下就有發(fā)現[30]。本研究中每天更換培養(yǎng)液可以在一定程度上消除代謝廢物的積累，但密度信號濾液經過24 h的預培養(yǎng)可能積累了大量的代謝廢物，其中的某些代謝物質的未知化學作用和自毒效果，也可致使種群的死亡率升高[31]，這可能是造成各實驗組之間種群增長差異的主要原因。

不同的物種自毒作用的表現程度不一樣，水蚤種群對密度信號非常敏感，大于85 個/L的水蚤濾液對小體型的水蚤(成年體長<1.8 mm)有抑制個體增長速率、使體型變小和尾棘刺變短的效果，但體型較大的水蚤沒有明顯的受到抑制[6]，說明這種抑制效果與體型有關。在輪蟲的相關研究中，梳狀疣毛輪蟲在100 個/mL的密度時就觀察到自毒作用對種群增長的抑制效果[11]，而圓形臂尾輪蟲(Brachionusrotundiformis)(體長約120 μm)在很高的密度(865 個/mL)下也沒有表現出對同種種群的抑制[32]。萼花臂尾輪蟲(體長約220 μm)自毒作用對種群的容納量K影響顯著，而角突臂尾輪蟲(體長110—150 μm)種群K值在100 個/mL時所受自毒作用的影響也不顯著。根據臂尾輪蟲的體型推斷，輪蟲受自毒作用的抑制也可能與輪蟲的體型有關系，自毒作用的強度隨著輪蟲體型的減小而降低。萼花臂尾輪蟲密度信號對角突臂尾輪蟲種群增長有抑制效果，角突臂尾輪蟲密度信號對萼花臂尾輪蟲種群無抑制效果，這有可能是由于角突臂尾輪蟲的密度信號中含有的對輪蟲種群產生抑制效果的代謝物質較少，而萼花臂尾輪蟲產生的能夠抑制輪蟲種群的代謝物質較多，但這個假說目前還缺乏實證。

綜合上述討論可以看出，造成密度信號對萼花臂尾輪蟲種群增長影響的主要因素是代謝產物的自毒作用，密度信號誘導的有性生殖對低有性生殖閾密度克隆的種群增長影響不明顯。而體型較小的角突臂尾輪蟲幾乎不受自毒作用的影響，這也是為何種群培養(yǎng)角突臂尾輪蟲可以用較小的培養(yǎng)體積，但萼花臂尾輪蟲必須用更大的培養(yǎng)體積的原因之一。此外體型較小的角突臂尾輪蟲食物濃度閾值更低，能更有效的利用低濃度的食物，因此在與萼花臂尾輪蟲的競爭中會在后期的資源競爭中取得優(yōu)勢[13]。在競爭的早期，食物對兩種輪蟲都是足夠的，不存在資源競爭的影響或其影響很小，而密度信號使種群快速增長，食物快速被消耗，從而使萼花臂尾輪蟲更早的面對資源競爭，更快的被角突臂尾輪蟲所排除。這可能是競爭早期的一種機制。而在高密度種群的時候，除食物資源的限制外，萼花臂尾輪蟲受自身密度信號的抑制使其在競爭中更加處于劣勢。但是在自然水體中還有捕食者的存在，體型較小的輪蟲會受到更大的捕食壓力，但是其快速的種群增長能力有可能使其實現在捕食者介導下與體型較大的萼花臂尾輪蟲的共存[20]。因此，可以推斷，在輪蟲的競爭中，決定競爭結果的不僅僅是資源競爭，密度信號的作用差異也對競爭結果有非常重要的影響。

致謝：感謝殷旭旺副教授對本文寫作的幫助。

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