王亞明，張桂東，尹清臣，朱建平，王靜

（1.邯鄲市中心醫(yī)院 普外一科，河北 邯鄲 056001；2.上海市第一人民醫(yī)院 危重病科，上海 松江 201620；3.邯鄲市中心醫(yī)院 病理科，河北 邯鄲 056001）

丹參酮IIa誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞MKN-45凋亡及對(duì)端粒酶活性的影響

王亞明1，張桂東1，尹清臣1，朱建平2，王靜3

（1.邯鄲市中心醫(yī)院 普外一科，河北 邯鄲 056001；2.上海市第一人民醫(yī)院 危重病科，上海 松江 201620；3.邯鄲市中心醫(yī)院 病理科，河北 邯鄲 056001）

目的考察丹參酮IIa（tanshinone IIa，Tan IIa）誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞的凋亡作用，以及對(duì)端粒酶活性的影響。方法不同濃度TanⅡa處理人胃癌細(xì)胞株MKN-45后，顯微鏡下觀察胃癌細(xì)胞形態(tài)變化，應(yīng)用Annexin V／PI雙重染色方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例，并用凋亡相關(guān)抗體檢測(cè)通路情況，用RT-PCR以及TRAP-PCR法分別對(duì)胃癌細(xì)胞端粒酶基因hTert和端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果TanⅡa處理胃癌細(xì)胞后，DAPI染色顯示，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)聚縮，細(xì)胞核碎裂并有凋亡小體產(chǎn)生，提示TanⅡa誘導(dǎo)胃癌MKN-45細(xì)胞凋亡。Annexin V／PI雙染結(jié)果顯示，凋亡比例隨化合物濃度提高而增加，40μM下晚期凋亡比例達(dá)到（45.02±6.48）%。凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)顯示，PARP和Caspase-3活化，細(xì)胞色素C水平增加，而Caspase-8則無(wú)顯著變化。同時(shí)TRAP-PCR結(jié)果顯示，Tan IIa在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)伴隨端粒酶活性下調(diào)，并在40μM下顯著抑制hTert基因的表達(dá)。結(jié)論TanⅡa對(duì)人胃癌細(xì)胞具有明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，且可能通過(guò)激活內(nèi)源性途徑引起細(xì)胞凋亡。TanⅡa還可抑制端粒酶活性和hTERT基因表達(dá)，這些可能是其發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制之一。

丹參酮IIa；胃癌；MKN-45；凋亡；端粒酶

丹參是我國(guó)傳統(tǒng)中藥中應(yīng)用較早，活性較為廣泛的藥物之一，近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，丹參脂溶性成分丹參酮類化合物具有明顯的抗腫瘤作用。并有不少報(bào)道顯示，其中的丹參酮IIa（tanshinone IIa，Tan IIa）可以通過(guò)細(xì)胞周期阻滯，顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)凋亡［2］，針對(duì)其他腫瘤如白血病的研究結(jié)果還顯示，除了可以誘導(dǎo)凋亡之外，Tan IIa可以發(fā)揮較為顯著的誘導(dǎo)分化的作用［3］。然而，目前針對(duì)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)信號(hào)通路的具體研究較少，而且對(duì)胃癌端粒酶活性是否有影響未見(jiàn)有報(bào)道，因此，本研究著重對(duì)丹參酮IIA針對(duì)胃癌凋亡相關(guān)通路進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步闡明Tan IIa誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制，此外將明確其對(duì)端粒酶的活性，有利于進(jìn)一步挖掘我國(guó)傳統(tǒng)抗腫瘤天然成分以及結(jié)構(gòu)類似物的潛力。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株MKN-45為本實(shí)驗(yàn)室保存。凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司。噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），4'，6二脒基-2-苯吲哚 （4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）購(gòu)自Sigma公司，Tan IIa（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110766-200619）中藥化學(xué)對(duì)照品，用二甲亞砜配制為10 mM儲(chǔ)液，除菌過(guò)濾儲(chǔ)存于－20℃冰箱避光備用，臨用時(shí)根據(jù)要求使用完全培養(yǎng)液稀釋為目標(biāo)濃度。無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute，RPMI）-1640培養(yǎng)液為 Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物科技有限公司。其余試劑均為分析純或者分子試劑級(jí)別。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及化合物處理：胃癌細(xì)胞株MKN-45培養(yǎng)在含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 RPMI-1640培養(yǎng)液中（含100 U／mL的青-鏈霉素），細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)前，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞用胰酶消化后，含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液終止消化并吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為8×104／mL，接種至96孔或6孔板中。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，加入化合物，即取Tan IIa儲(chǔ)液用完全培養(yǎng)液稀釋至目標(biāo)濃度，替換原來(lái)培養(yǎng)液，空白對(duì)照組換新鮮的完全培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察：細(xì)胞爬片后，用Tan IIa不同濃度處理48 h后，冷甲醇固定，使用DAPI進(jìn)行染色5min，磷酸緩沖液（phosphatic buffer saline，PBS）洗1次，將有細(xì)胞的一面倒扣于事先滴加有熒光防淬滅劑載玻片上。用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 凋亡細(xì)胞比例檢測(cè)：使用膜聯(lián)蛋白V（annexin V）／PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡比例，不同濃度丹參酮IIa處理48h后，消化收集胃癌細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，冷PBS再洗2次，用試劑盒中1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和5μL碘化丙啶，彈勻后置于暗處室溫孵育15min，取出細(xì)胞懸液過(guò)10μm孔徑尼龍膜后轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞樣本管中，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測(cè)。設(shè)置空白對(duì)照和單染組細(xì)胞用于流式細(xì)胞設(shè)“門”，每次分析10 000個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 免疫印跡：使用冷的PBS淋洗2遍，細(xì)胞置于冰上，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞蛋白后在10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）膠上電泳。蛋白分離后經(jīng)恒流1.5 h電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后，使用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h，與Bcl-3特異性抗體室溫孵育1 h或者4℃過(guò)夜后，次日加入二抗室溫作用1 h后，洗膜緩沖液（tris buffered saline tween，TBST）洗膜3次，取出膜后加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光液，暗室中壓片顯影。

1.2.5 端粒酶表達(dá)檢測(cè)：不同濃度Tan IIa處理的胃癌細(xì)胞使用冷PBS漂洗一遍后，使用Trizol（Invitrogen）進(jìn)行RNA提取，具體方法參考Trizol使用說(shuō)明，使用Nanodrop 2000檢測(cè)所得RNA的質(zhì)量。用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將得到的RNA為模板，使用Oligo dT為引物轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA用Nanodrop 2000檢測(cè)產(chǎn)量和純度，按照以下方法以cDNA為模板，擴(kuò)增端粒酶催化亞單位，所用引物序列，hTERT：hTERT：上游5’-TCC ACT CCC CAC ATA GGA ATA GTC-3’，下游5’-TCC TTC TCA GGG TCT CCA CCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為 110bp；β-actin：上游 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為250 bp。按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系配置PCR反應(yīng)液，置于PCR儀中按照以下程序進(jìn)行反應(yīng)：95℃變性5min后，按照94℃ 30 s，68℃20 s，72℃ 40 s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，16℃保溫。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上分離后，使用天能成像系統(tǒng)拍照并使用隨機(jī)軟件進(jìn)行條帶灰度分析，以hTERT／β-actin比值作為最后的結(jié)果。

1.2.6 端粒酶活性檢測(cè)：采用TRAP-PCR銀染法檢測(cè)端粒酶活性，具體操作按北京天恩澤試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。分別收集經(jīng)不同濃度TanⅡa作用48 h后的胃癌細(xì)胞1×106個(gè)，預(yù)冷的PBS洗滌，細(xì)胞沉淀加入200μL的細(xì)胞裂解液，渦旋10s后冰浴30min充分裂解細(xì)胞，12 000 g 4℃離心20min后收集上清分裝、測(cè)定蛋白濃度后用于端粒酶延伸反應(yīng)。設(shè)置好陰性對(duì)照，根據(jù)試劑盒中說(shuō)明配置反應(yīng)體系，室溫30min后模板DNA上可以加上不同數(shù)量的6 bp長(zhǎng)的重復(fù)序列（TTAGGG），93℃3min滅活端粒酶，得到的混合反應(yīng)體系加入引物和Taq DNA聚合酶1μL后直接用于PCR擴(kuò)增，根據(jù)說(shuō)明書中設(shè)置擴(kuò)增條件，取20μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物用于10%非變性PAGE電泳，分離得到的凝膠使用銀染法進(jìn)行顯色和拍照。

2 結(jié)果

2.1 TanⅡa對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響 使用不同濃度的TanⅡa作用MKN-45胃癌細(xì)胞72 h后，用Dapi對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，如圖1A所示隨著濃度的升高，凋亡細(xì)胞所占的比例逐漸增高，使用1000倍觀察后顯示不少細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡情況，包括染色質(zhì)凝聚（引起熒光信號(hào)強(qiáng)度增加），核碎裂，凋亡小體產(chǎn)生等（圖1B），以上結(jié)果顯示丹參酮IIa對(duì)MKN-45具有比較強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖1 TanⅡa作用MKN-45 72 h后細(xì)胞核DAPI染色結(jié)果A：200倍放大倍率下所得的圖像；B：放大TanⅡa 40μM處理組1000倍以后得到的圖像。標(biāo)尺顯示為100μmFig.1 Stained result of nucleiMKN-45 with 72 h-treatment of TanⅡaA：The image was obtained with themagnification of200 times；B：MKN-45 was treated with TanⅡa at40μM and an enlarged image was obtained with magnification of1 000 times.Sale display is 100μm

進(jìn)一步收集Tan IIa處理48 h的胃癌細(xì)胞，使用Annexin V／PI雙染檢測(cè)不同時(shí)期凋亡細(xì)胞比例，得到表1的結(jié)果，從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)高濃度丹參酮IIa處理后，細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，也有不少比例的細(xì)胞發(fā)生壞死。晚期凋亡細(xì)胞與對(duì)照組比較具有顯著差異（P＜0.05），且隨著劑量增加，早期凋亡、晚期凋亡與壞死細(xì)胞比例逐漸升高，說(shuō)明Tan IIa對(duì)胃癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。

表1 TanⅡa對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響（%）Tab.1 Apoptosis rate of gastric cancer after treatmentwith TanⅡa（%）

2.2 TanⅡa對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路的影響 為了進(jìn)一步探索TanⅡa作用胃癌細(xì)胞引起凋亡的具體作用機(jī)制，首先對(duì)PARP和Caspase-3進(jìn)行檢測(cè)，MKN-45細(xì)胞與不同濃度的Tan IIa作用48h后，裂解細(xì)胞，進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白。與2.1結(jié)果相一致的是，隨著Tan IIa濃度的升高，代表DNA損傷的PARP剪切形式也逐漸的增加，Caspase-3被活化，其前體水平逐漸下調(diào)，活化形式增加（見(jiàn)圖2A）。為了進(jìn)一步區(qū)分凋亡是通過(guò)內(nèi)源性還是外源性途徑，對(duì)細(xì)胞色素C（Cyto C）和Caspase-8進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示代表內(nèi)源性途徑的細(xì)胞色素C在Tan IIa作用下從線粒體中釋放入胞漿中，而Caspase-8的水平未見(jiàn)有顯著的變化，以上的結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)Tan IIa誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有濃度依賴性，而且提示主要通過(guò)內(nèi)源性凋亡途徑發(fā)揮作用。

圖2 Tan IIa對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)分子的影響圖A不同濃度Tan IIa作用后對(duì)PARP和Caspase-3活化的影響；圖B不同濃度Tan IIa作用后對(duì)細(xì)胞色素C（Cyto C）和Caspase-8表達(dá)的影響Fig.2 Diagram show of the influence of apoptosis-related signalingmolecules after treatment with difference concentration of Tan IIaFig.A Activation of PARP and Caspase-3 were detected by western blot；Fig.B The expression of cytochrome C（Cyto C）and Caspase-8 with treatmentwith different concentrations of Tan IIa

2.3 Tan IIa對(duì)hTert表達(dá)以及活性的影響 Tan IIa處理后，以β-actin表達(dá)為內(nèi)參，得到以下表達(dá)數(shù)據(jù)（見(jiàn)表2），hTert的表達(dá)水平略有下降，但是不同濃度中，在20μM 48 h以及40μM 24 h和48 h時(shí)候，出現(xiàn)顯著的表達(dá)差異（P＜0.05）。進(jìn)一步的對(duì)hTert活性進(jìn)行檢測(cè)后顯示，隨著Tan IIa濃度的增加，hTERT的活性逐漸下調(diào)，表現(xiàn)為間隔6 bp左右的銀染條帶組逐漸減弱。

表2 TanⅡa對(duì)hTert表達(dá)水平的影響Tab.2 The expression of hTERT gene after treamentwith TanⅡa

圖3 TRAP-PCR法檢測(cè)不同濃度Tan IIa對(duì)端粒酶活性的影響Fig.3 Telomerase activity of MKN-45 was detected by TRAP-PCRmethod with different concentrations of Tan IIa

3 討論

目前針對(duì)丹參的化學(xué)成分研究主要集中在其脂溶性成分方面，可以大概分為2類，即丹參酮類和羅列酮類，本文所研究的丹參酮Ⅱa即屬于前一類，為一種生物堿，在目前分離得到近40余種的丹參類生物堿中，以TanⅡa的抗腫瘤活性最強(qiáng)［4］。本研究首先在體外加入不同濃度的Tan IIa，利用DAPI熒光染色后，可以將細(xì)胞核進(jìn)行染色，DAPI染色后，可以在熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)，即染色質(zhì)濃縮并主要聚集于核膜下，呈現(xiàn)境界分明的顆粒狀，有部分細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂和凋亡小體，以上都提示TanIIa處理MKN-45后有細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡狀態(tài)，隨濃度增加，鏡下顯示這種具有凋亡特征的細(xì)胞比例增加，用Annexin／PI雙染后檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例的分析手段進(jìn)一步證實(shí)，隨藥物濃度增加，凋亡比例增加。提示TanⅡa對(duì)MKN-45胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用存在一定劑量和時(shí)間范圍內(nèi)具有顯著的量效關(guān)系，提示丹參酮具有直接殺傷能力，因此，誘導(dǎo)凋亡是TanⅡa體內(nèi)外抗腫瘤的機(jī)制之—。

進(jìn)一步分析Tan IIa的分子結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，其分子環(huán)中存在菲環(huán)、呋喃環(huán)和醌類結(jié)構(gòu)，菲環(huán)可以結(jié)合DNA，而呋喃環(huán)和醌類結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生自由基，進(jìn)而引起DNA損傷［5］，這點(diǎn)在本研究中通過(guò)多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的檢測(cè)得到比較明顯的體現(xiàn)，PARP在DNA損傷以及細(xì)胞程序性死亡中活化并上調(diào)，可作為凋亡早期的敏感標(biāo)志［6］。進(jìn)一步對(duì)Caspase-3的檢測(cè)不僅驗(yàn)證前面的DAPI染色的現(xiàn)象，而且在分子水平證明存在比較明確的凋亡現(xiàn)象。

Caspase-3在Caspase家族中屬于執(zhí)行蛋白，處于Caspase分子級(jí)聯(lián)“瀑布”下游，作為關(guān)鍵的蛋白酶，通過(guò)激活Caspase-3，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Tan IIA不僅能激活反應(yīng)DNA損傷程度的PARP，而且可以上調(diào)Caspase-3活化形式表達(dá)，最后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

根據(jù)凋亡發(fā)生途徑的差異，可將凋亡類型大致分為內(nèi)源性途徑和外源性途徑，前者又稱為線粒體途徑，主要表現(xiàn)為線粒體內(nèi)相關(guān)蛋白如細(xì)胞色素C（Cyto C）釋放，Bax表達(dá)以及線粒體膜電位改變等，而后者則主要以 Fas／FasL為代表，體現(xiàn)為下游Caspase-8的活化。本研究顯示Tan II誘導(dǎo)的凋亡主要可能為線粒體途徑，表現(xiàn)TanⅡa作用后細(xì)胞色素C的大量表達(dá)。針對(duì)Caspase-8的檢測(cè)也提示有一定程度的活化，但是程度不如細(xì)胞色素C明顯，這也提示，細(xì)胞中的信號(hào)通路往往不是非此即彼的關(guān)系，可能還存在較多的交互作用網(wǎng)絡(luò)，比如Zhang等人研究顯示，大蒜素可通過(guò)同時(shí)活化外源性和內(nèi)源性2條途經(jīng)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡［7］。

盡管國(guó)內(nèi)有不少體外實(shí)驗(yàn)表明，TanⅡa對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制或殺傷作用，對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤如K562、HL260以及肝癌HepG2細(xì)胞均有明顯的抑制作用［8］，并能誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞分化。但是既往的研究著重對(duì)于丹參酮Ⅱa在細(xì)胞增殖方面的研究［2，9-10］，通過(guò)引起細(xì)胞周期阻滯，上調(diào)p53引起細(xì)胞增殖抑制等方面［11］。雖然也提示存在凋亡現(xiàn)象，但對(duì)于引起凋亡所涉及的具體通路鮮有涉及，而本研究恰恰彌補(bǔ)了該方面的空白，通過(guò)對(duì)凋亡內(nèi)、外途徑中典型代表蛋白進(jìn)行分析，基本闡明其信號(hào)通路主要通過(guò)內(nèi)源性途徑（也就是線粒體途徑）實(shí)現(xiàn)。通過(guò)釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-3系統(tǒng)，最后引起細(xì)胞凋亡。

端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，主要由端粒酶相關(guān)蛋白（TPl）、端粒酶 RNA（hTR）和 hTERT3部分組成［12］。正常細(xì)胞在分裂時(shí)候，在染色體末端會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性縮短，導(dǎo)致分裂次數(shù)受限，細(xì)胞可以分化或凋亡，而不至于無(wú)限制的增殖。而端粒酶的作用是在復(fù)制期時(shí)，在染色體末端提供TTAGGG這樣的重復(fù)片段，使細(xì)胞得以無(wú)限增殖，導(dǎo)致細(xì)胞永生和腫瘤的產(chǎn)生［13］。端粒酶的活性和表達(dá)水平提示細(xì)胞無(wú)限增殖的水平和能力，本研究顯示Tan IIa不僅可誘導(dǎo)MKN-45發(fā)生凋亡，而且可以抑制端粒酶的活性以及對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，在高濃度時(shí)，效應(yīng)尤為顯著，提示細(xì)胞凋亡與端粒酶抑制可能同時(shí)發(fā)生，并存在密切聯(lián)系。該結(jié)果也與丹參酮I（Tan I）在單核粒細(xì)胞白血病的研究結(jié)果相一致，該研究也發(fā)現(xiàn)，丹參酮I體外作用單核粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937，THP-1和SHI1后，引起Caspase-3活性的上調(diào)和端粒酶活性下降［14］。研究顯示，凋亡過(guò)程中由于存在細(xì)胞膜完整性的破壞以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)和活化，這些因素都可以直接或者間接的影響到端粒酶基因的表達(dá)和活性［15］。但是相關(guān)調(diào)控的時(shí)序性以及具體細(xì)節(jié)有待進(jìn)一步的研究和豐富。因此，TanⅡa如何是否通過(guò)影響凋亡抑制基因如Caspase-3等的表達(dá)而影響端粒酶活性，有待進(jìn)一步的研究。總的來(lái)看，TanⅡa不僅可以通過(guò)內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，而且可以顯著抑制端粒酶的表達(dá)和活性，從不同角度抑制癌細(xì)胞的增殖和進(jìn)展，因此對(duì)其構(gòu)效關(guān)系的研究以及凋亡相關(guān)蛋白和端粒酶活性之間的相關(guān)研究，將為進(jìn)一步挖掘丹參酮類似物以及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為發(fā)揚(yáng)我國(guó)傳統(tǒng)中藥，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化以及天然藥物的分子活性研究提供范例。

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（編校：譚玲）

Tanshinone IIa induced apoptosis on human gastric cancer cells MKN-45 and its effect on telomerase activity

WANG Ya-ming1，ZHANG Gui-dong1，YIN Qing-chen1，ZHU Jian-ping2，WANG Jing3

（1.First Department of General Surgery，Central Hospital of Handan，Handan 056001，China；2.Department of Critical Care，The First People's Hospital of Shanghai，Songjiang 201620，China；3.Department of Pathology，
Central Hospital of Handan，Handan 056001，China）

ObjectiveTo investigate the induced apoptosis effect of tanshinone IIa（Tan IIa）on human gastric cancer cells，aswell as telomerase activity.MethodsAfter treatmentwith different concentration of TanⅡ，gastric cancer cell line MKN-45 cellswere stained with DAPIand morphology changes were observed under amicroscope，Annexin V／PI double staining was carried to detect the proportion of apoptosis cells，furthermore apoptosis pathway relateswere also detected by western blot.Then RT-PCR and TRAP-PCRmethodswere used to detect the expression of telomerase gene hTERT and telomerase activity respectively.ResultsAfter Tan IIa treatment of gastric cancer cells，DAPI staining showed that the nuclear chromatin condensation and polymerization，nuclear fragmentation and apoptotic bodies produced，all of which indicated Tan IIa could induce the apoptosis of gastric cancer cell line MKN-45.Annexin V／PIdouble staining showed that the proportion of apoptotic increased with the increased concentration of Tan IIa，and ratio of later apoptotic cells could reached（45.02±6.48）%at 40μM.Detection of apoptosis-related proteins showed that，PARP and Caspase-3 activation，Cyto C levels increased，and Caspase-8 showed no significant changes.Meanwhile，TRAP-PCR results showed that，in company with Tan IIa-induced apoptosis，telomerase activity and the expression of hTERT genes were significantly inhibited under 40μM.ConclusionTan IIa induce the apoptosis of human gastric cancer cells through activation of endogenous pathways，futhermore，the inhibition of telomerase activity and hTERT gene expression，which may be one of the importantmechanisms by these pharmacologic activity.

tanshinone IIa；gastric cancer；apoptosis；telomerase

R735.2

A

1005－1678（2014）05－0044－05

胃癌已成為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居高不下，腫瘤發(fā)展與細(xì)胞增殖過(guò)度和分化失調(diào)密切相關(guān)，其中端粒酶的活性與腫瘤的增殖和分化均密切相關(guān)，端粒酶的活化引起細(xì)胞永生，端粒的長(zhǎng)度可影響癌細(xì)胞分化。胃癌患者中端粒酶hTert陽(yáng)性率可高達(dá)97.5%［1］，可作為評(píng)價(jià)胃癌病情發(fā)展的重要指標(biāo)之一。

邯鄲市科學(xué)技術(shù)與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（1223108085－4）

王亞明，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病機(jī)制及綜合治療，E-mail：drwyming＠126.com。