李標(biāo)，林偉民，田樹紅，李凡，李富

（1.海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院 胸外科，海南 ?？?570311；2.海南醫(yī)學(xué)院 安評(píng)中心，海南 ?？?570100）

科羅索酸的抗腫瘤作用及其對(duì)CAM和YSM血管生成的影響

李標(biāo)1，林偉民1，田樹紅2，李凡1，李富1

（1.海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院 胸外科，海南 ?？?570311；2.海南醫(yī)學(xué)院 安評(píng)中心，海南 海口 570100）

目的探究科羅索酸（corosolic acid，CRA）的抗腫瘤作用及其對(duì)雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM）和卵黃囊膜（yolk sacmembrane，YSM）血管生成的影響。方法MTT法檢測(cè)CRA對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的影響。將生物發(fā)光標(biāo)記的人肺癌細(xì)胞A549接種到裸小鼠體內(nèi)，建立生物發(fā)光標(biāo)記的裸小鼠荷瘤模型，采用IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況。采用雞胚孵化實(shí)驗(yàn)，觀察CRA對(duì)CAM和YSM血管生成的影響。結(jié)果CRA對(duì)A549增殖抑制的IC50值為26.8μg／mL。荷瘤動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明：CRA對(duì)A549實(shí)體瘤有顯著的抑制生長(zhǎng)作用（P＜0.01）。在雞胚孵化實(shí)驗(yàn)中，CRA可明顯降低CAM和YSM血管生成。結(jié)論CRA對(duì)A549具有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制腫瘤組織中血管生成有關(guān)。

科羅索酸；A549；雞胚絨毛尿囊膜；卵黃囊膜

腫瘤的血管生成在實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)過程中起著關(guān)鍵性的作用，為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，并為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供條件［1］。通常情況下，腫瘤組織的血管組織較為發(fā)達(dá)，因此，研發(fā)靶向抑制腫瘤血管組織的藥物也具有較為廣闊的應(yīng)用前景。雞胚絨毛尿囊膜和卵黃囊膜是體外研究藥物對(duì)血管生成影響的常用方法［1-4］，具有操作簡(jiǎn)單和重復(fù)性好等特點(diǎn)［5-6］。本研究通過體外和體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)探討科羅索酸（corosolic acid，CRA）對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制作用，及其對(duì)平皿中培養(yǎng)的雞胚尿囊膜和卵黃囊膜血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物：人肺癌細(xì)胞A549，購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，委托上海樂晨生物科技有限公司進(jìn)行生物發(fā)光標(biāo)記。50只Balb／c裸小鼠，鼠齡4～5周，體重18～23 g。購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2014-0003。

1.1.2 試劑與儀器：RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)于賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，麻醉劑異氟烷購(gòu)于河北九派制藥有限公司。熱電（上海）儀器有限公司生產(chǎn)的MK3酶標(biāo)，精諾真的IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，美國(guó)MATRX的VMR小動(dòng)物專用吸入麻醉機(jī)，解剖顯微鏡帶拍照系統(tǒng)。無菌干燥培養(yǎng)皿、濾紙片、75%（mL／mL）乙醇、種蛋等。

1.2 方法

1.2.1 體外抗腫瘤試驗(yàn)：MTT法檢測(cè)科羅索酸對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的體外抗腫瘤活性。采用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化并離心。接種于96孔板，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后加入CRA，使其終質(zhì)量濃度為分別分別為0、2、4、8mg／mL。24 h后，加入 5 mg／mL的 MTT溶液 20 uL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 uL DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的光密度值（OD值），計(jì)算 IC50。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（A空白對(duì)照組－ACRA組）／A空白對(duì)照組×100%。

1.2.2 體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)：①人肺癌細(xì)胞A549荷瘤動(dòng)物模型的建立：50只SPF級(jí)健康的雌性裸小鼠，右側(cè)頸背部皮下接種A549細(xì)胞懸液0.2mL，以IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能檢測(cè)到接種細(xì)胞作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。②IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況：取接種成功的裸小鼠40只，隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組、低劑量和模型組，每組10只。高、中、低給藥組灌胃科羅索酸，給藥劑量分別為8、4、2mg／mL；模型組給予生理鹽水。所有裸小鼠每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。給藥前和給藥期間采用IVISKinetics小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)實(shí)體瘤生長(zhǎng)情況。

1.2.3 雞胚的孵育：將新鮮的受精雞蛋用75%（mL／mL）酒精擦拭消毒后，氣室朝上，與蛋托呈約45°角放入37.5℃孵化箱中孵化3 d。孵化箱內(nèi)的相對(duì)濕度范圍為50%～60%，每天轉(zhuǎn)蛋3次。實(shí)驗(yàn)共分為科羅索酸高、中、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組和模型組。每組20只雞蛋，共100只。

孵化第4天時(shí)，在凈化工作臺(tái)內(nèi)用砂輪在蛋殼中間位置橫向磨一道約2 cm長(zhǎng)的切口，然后沿切口方向掰開蛋殼，將雞胚移入無菌干燥的玻璃培養(yǎng)皿中，蓋好蓋子，放入孵化箱中繼續(xù)孵育。孵育第7天，CAM直徑長(zhǎng)約10 mm，YSM血管直徑長(zhǎng)約15mm，用移液器將待測(cè)藥物3μL加到濾紙片上，放置于CAM和YSM之間血管較少的部位，繼續(xù)孵化24 h。然后，用解剖顯微鏡觀察濾紙片周圍CAM和YSM的血管密度和走向，并拍照。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤抑制率 CRA質(zhì)量濃度為 0、2、4、8mg／mL時(shí)，對(duì)應(yīng)的 OD值為 2.153，1.82，1.167，0.404，抑制率分別為 0%，15.47%，45.8%，81.23%。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，科羅索酸對(duì)腫瘤細(xì)胞株 A549的 IC50為26.8μg／mL。

2.2 CRA對(duì)A549實(shí)體瘤小鼠的治療作用 對(duì)接種了A549腫瘤細(xì)胞的小鼠給予科羅索酸或生理鹽水灌胃，14 d后活體成像檢測(cè)小鼠實(shí)體瘤大小。結(jié)果顯示給藥科羅索酸后小鼠實(shí)體腫瘤明顯小于模型組，說明一定濃度的科羅索酸能抑制荷瘤小鼠體內(nèi)實(shí)體瘤的增長(zhǎng)。其中，隨著給藥劑量的增加小鼠體內(nèi)實(shí)體腫瘤的體積減小，特別是當(dāng)給藥劑量為8mg／kg時(shí)，實(shí)體腫瘤體積最小，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系?？屏_索酸高劑量組給藥后14 d腫瘤細(xì)胞數(shù)與給藥前相比明顯減少。溶媒對(duì)照組動(dòng)物給藥前與給藥后14 d比較，可見腫瘤細(xì)胞數(shù)量增加明顯（見圖1、圖2）。

圖1 實(shí)驗(yàn)各組實(shí)體瘤給藥前后生長(zhǎng)情況＃P＜0.01，與各給藥組相比；*P＜0.01，與其他兩給藥組相比Fig.1 Comparison of solid tumormass before and after dosing in four groups＃P＜0.01，compared with three CRA groups；*P＜0.01，compared with other two CRA groups

圖2 高劑量科羅索酸（8mg／mL）給藥前（a）和給藥后（b）對(duì)裸鼠A549實(shí)體瘤生長(zhǎng)的影響Fig.2 A549 tumor growth in nudemice before（a）and after（b）given high dose CRA（8mg／mL）for 14 days

2.3 CRA對(duì)雞胚血管生成的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物作用雞胚24 h后，溶媒對(duì)照組血管生長(zhǎng)正常，主次血管清晰分明，新生血管豐富，血色正常。科羅索酸給藥組（8mg／mL）與溶媒對(duì)照組比較，在含藥液濾紙片下即周圍CAM和YSM無血管生成或血管斷裂消失（見圖3）。

圖3 CRA對(duì)CAM和YSM血管生成的影響Fig.3 Effect of CRA on the generation of CAM and YSM blood vessel

3 討論

近年來研究表明，各種腫瘤特別是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤組織中血管形成密切相關(guān)，腫瘤組織中血管的密度顯著性的高于其他正常組織［7］，并且在癌癥組織中相應(yīng)的促血管生成因子表達(dá)也較高。袁捷等［8］研究認(rèn)為在胃癌組織中相應(yīng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)異常增高，并且癌癥組織中微血管的密度相對(duì)于正常組織異常增高。因此近年來以腫瘤血管為目標(biāo)的抗血管生成治療腫瘤日益成為研究的熱點(diǎn)，并且取得了顯著的成果。如沙利度胺可通過抑制血管生成從而很好的抑制腫瘤生長(zhǎng)［9］。在本研究中將腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行生物發(fā)光標(biāo)記后植入小鼠體內(nèi)，再用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。這樣可以在無創(chuàng)傷的情況下時(shí)時(shí)定量檢查小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況，而且只有活細(xì)胞才會(huì)被檢測(cè)到［10-11］。傳統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)采用測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑來大致計(jì)算實(shí)體瘤的體積。這種方法誤差較大，而且腫瘤組織的壞死部分也會(huì)因?yàn)闊o法判斷而被忽略［12-14］。通過上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明科羅索酸可以明顯抑制小鼠實(shí)體腫瘤的增長(zhǎng)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明科羅索酸能明顯抑制人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明科羅索酸有很好的抗腫瘤活性。

科羅索酸（corosolic acid，CRA），又名2α－羥基熊果酸，為一種天然的五環(huán)三萜酸。近年來研究表明科羅索酸具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用，也有研究表明科羅索酸對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，其對(duì)肝癌細(xì)胞，胃癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用［15］。前期通過免疫組化方法初步分析了CRA對(duì)A549的抗腫瘤活性可能與影響腫瘤組織中血管生成有關(guān)。在本研究中采用傳統(tǒng)的雞胚平皿法［16］，考察科羅索酸對(duì)雞胚CAM和YSM血管生成的影響，研究結(jié)果表明科羅索酸可顯著抑制雞胚CAM和YSM中血管生成，這一研究結(jié)果表明科羅索酸的抗腫瘤作用機(jī)制可能是通過抑制腫瘤中血管生成而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，科羅索酸具有良好的抗腫瘤的活性，能明顯抑制CAM和YSM中血管生成，提示科羅索酸的抗腫瘤活性是通過抑制腫瘤中血管生成而實(shí)現(xiàn)的。

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（編校：吳茜）

Antitumor effect of corosolic acid and it's impact on CAM and YSM angiogenesis

LIBiao1，LINWei-ming1，TIAN Shu-hong2，LIFan1，LIFu1

（1.Department of thoracic surgery，Hainan Province Nongken Hospital，Haikou 570311，China；2.Safety Evaluation Center，Hainan Medical College Haikou 570100，China）

ObjectiveTo evaluate the antitumor effect of corosolic acid and its impact on CAM and YSM angiogenesis.MethodsThe effects of CRA on A549 proliferation was studied by MTTmethod in vitro.Tumor-bruden nude mice model were established by injecting A549 lung cancer cell marked with bioluminescent to nude mice，and the growth of tumor in mice were detected by IVIS small animal in vivo imaging system.Experiment of chicken embryos eggs are used to observe the role of drugs on CAM and YSM blood vessels.ResultsThe value of IC50of CRA for A549 in vitrowas26.8 μg／mL.A tumor-burdened animal experiment results showed that the CRA to A549 solid tumor has a certain therapeutic effect.CAM and YSM blood vessels of chicken embryos eggs treated with CRA were decreased significantly than negative control group.ConclusionCRA has certain therapeutic effect for A549，whichmay be related to the inhibition of angiogenesis in tumor tissues.

corosolic acid；A549；chick chorioallantoicmembrane；YSM

R734

A

1005－1678（2014）04－0022－03

海南省自然科學(xué)基金（813243）

李標(biāo)，男，本科，副主仼醫(yī)師，研究方向：肺癌臨床及基礎(chǔ)研究，E-mail：358342097＠qq.com。