李宗祥，孫平

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

蒽貝素聯(lián)合阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖和荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

李宗祥，孫平Δ

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

目的探討阿霉素（doxorubicin，DOX）聯(lián)合X連鎖凋亡抑制蛋白小分子抑制劑蒽貝素（embelin，EB）對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖及荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。方法根據(jù)加入藥物的不同將MCF-7細(xì)胞分為生理鹽水組、阿霉素干預(yù)組、蒽貝素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組（蒽貝素＋阿霉素）。MTT法檢測(cè)各組對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況。構(gòu)建乳腺癌MCF-7細(xì)胞腫瘤球模型，探討阿霉素聯(lián)合蒽貝素對(duì)腫瘤球的生長(zhǎng)抑制作用。建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型，探討阿霉素聯(lián)合蒽貝素對(duì)乳腺癌異位瘤的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果乳腺癌MCF-7細(xì)胞在給藥后48h，聯(lián)合干預(yù)組對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率顯著大于其他給藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和腫瘤球生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)都表明聯(lián)合干預(yù)組的腫瘤細(xì)胞抑制能力顯著強(qiáng)于其他組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合干預(yù)組的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用顯著強(qiáng)于其他組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論阿霉素與蒽貝素均具有抑制乳腺癌增殖的作用，2者聯(lián)合應(yīng)用能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)抗腫瘤能力。

阿霉素；蒽貝素；乳腺癌

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司）；阿霉素（浙江海正藥業(yè)，批號(hào)：14202）；蒽貝素（美國(guó) sigma公司）；其余試劑為分析純。人源乳腺癌細(xì)胞（MCF-7，ATCC）。雌性裸鼠（20～30 g，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：WHDX20102372）。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)：將MCF-7細(xì)胞置于含有100mg／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，飽和濕度，溫度為37℃。待細(xì)胞匯合度為0.8～0.9時(shí)，用2.5mg／L胰蛋白酶消化傳代，取增殖期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT檢測(cè)不同藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用：將MCF-7細(xì)胞分為生理鹽水組、阿霉素干預(yù)組、蒽貝素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組（蒽貝素＋阿霉素）。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)分別加入無(wú)菌過(guò)濾后的蒽貝素溶液（40mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽貝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15 mmol／mL）溶液。將孔板移入37℃5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后取出，每孔加入20μL 5 g／LMTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h。將孔板中液體倒出，每孔加入200μL DMSO，37℃避光振搖15min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔的吸光度值（A）。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：按“1.2.2”方法培養(yǎng)細(xì)胞并分組，給藥后將MCF-7細(xì)胞繼續(xù)培24 h，用冰PBS清洗細(xì)胞3次，F(xiàn)ITC／PI雙染，細(xì)胞避光放置15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.2.4 腫瘤球生長(zhǎng)變化檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，用0.125%的胰酶消化，含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，輕輕吹打細(xì)胞后離心，棄上清。加培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于低熔點(diǎn)瓊脂糖預(yù)處理的96孔板。37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)。腫瘤球生長(zhǎng)7 d后，加入無(wú)菌過(guò)濾后的蒽貝素溶液（40 mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽貝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15 mmol／mL）溶液。以生理鹽水為陰性對(duì)照，統(tǒng)計(jì)腫瘤球體積大小變化。腫瘤球體積變化率 ＝（Vn－V0）／V0。

1.2.5 乳腺癌異位腫瘤模型的建立：MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心后，懸浮于DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)濃度至5×107個(gè)／mL。取4～6周齡，體質(zhì)量20～30 g的雌性裸鼠60只，于皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1mL細(xì)胞懸濁液。接種后1～2周可見(jiàn)背部長(zhǎng)出腫瘤塊，證明接種成功。將優(yōu)選后的40只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成4組，分別腹腔注射蒽貝素溶液（40mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽貝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15mmol／mL）溶液各 1mL，第 3、6、9、12天給藥。第21天處死小鼠，剖腫瘤，稱(chēng)重。計(jì)算抑瘤率腫瘤組織切片，TUNEL染色，照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“±s”表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各處理組對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用 MTT結(jié)果顯示：阿霉素和蒽貝素均能顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖（P＜0.05），且隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制率逐漸上升（P＜0.05）。聯(lián)合干預(yù)組對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力顯著高于各單獨(dú)給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見(jiàn)圖1）。

圖1 不同藥物干預(yù)組對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，與生理鹽水組比較；**P＜0.01，與蒽貝素組和阿霉素組比較；ΔP＜0.01，與聯(lián)合干預(yù)組相比Fig.1 MCF-7 cell viability at various drugs at24 h and 48h after the treatment＃P＜0.01，compared with saline group；**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group；ΔP＜0.01，compared with combination group（doxorubicin＋embelin）at24 h

2.1 各處理組對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡作用 流式檢測(cè)結(jié)果顯示：與生理鹽水組相比，阿霉素、蒽貝素和聯(lián)合干預(yù)組均能不同程度誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡（P＜0.01）。且聯(lián)合干預(yù)組誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著強(qiáng)于2單獨(dú)干預(yù)組組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見(jiàn)圖2）。

圖2 不同藥物干預(yù)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡率ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，與生理鹽水組比較；**P＜0.01，與阿霉素組和蒽貝素組相比Fig.2 MCF-7 cells induced apoptosis by embelin and doxorubicin ΔP＜0.01，compared with saline group；**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group

2.2 各處理組對(duì)腫瘤球生長(zhǎng)的抑制作用 腫瘤球的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：阿霉素和蒽貝素均能明顯抑制腫瘤球的生長(zhǎng)，且聯(lián)合干預(yù)組對(duì)腫瘤球生長(zhǎng)抑制率顯著高于其他2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見(jiàn)圖3）。

圖3 不同藥物干預(yù)對(duì)腫瘤球生長(zhǎng)抑制率**P＜0.01，與蒽貝素組和阿霉素組相比Fig.3 The inhibition of tumor spheroids by embelin and doxorubicin**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group

2.4 各處理組對(duì)裸鼠皮下移植腫瘤生長(zhǎng)的作用 對(duì)荷瘤裸鼠的治療實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合干預(yù)組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率顯著強(qiáng)于其他組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見(jiàn)表1）。各組裸鼠腫瘤組織切片后TUNEL染色，棕色代表凋亡的腫瘤細(xì)胞，圖4可見(jiàn)，聯(lián)合干預(yù)組誘導(dǎo)凋亡的腫瘤細(xì)胞最多，其次是阿霉素干預(yù)組和蒽貝素干預(yù)組。

表1 不同藥物干預(yù)對(duì)乳腺癌移植瘤的抑制率Tab.1 The inhibition of breast tumor by different drugs

圖4 腫瘤組織切片TUNEL染色（×200）Fig.4 TUNEL staining of tumor tissues（×200）

3 討論

蒽貝素是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種有效的小分子X(jué)IAP抑制劑，其抗腫瘤活性已經(jīng)得到了廣泛關(guān)注。鄭玲等［10］觀察了蒽貝素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示蒽貝素具有良好的誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用。史朝暉等［11］觀察了蒽貝素對(duì)大腸癌細(xì)胞的增殖抑制效果，得到了相同的結(jié)果。本研究將阿霉素與蒽貝素聯(lián)合用于乳腺癌的治療研究。研究結(jié)果表明，阿霉素聯(lián)合蒽貝素能夠有效抑制MCF-7腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在某些實(shí)體腫瘤組織中，由于腫瘤組織致密生長(zhǎng)，腫瘤內(nèi)部壓力高且血管少，因此抗腫瘤藥物很難進(jìn)入腫瘤組織深部［12-15］。本研究構(gòu)建了體外乳腺癌腫瘤球模型用于評(píng)價(jià)聯(lián)合給藥的抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，蒽貝素和阿霉素都能夠抑制腫瘤球的生長(zhǎng)，聯(lián)合給藥比各單獨(dú)給藥更能有效抑制腫瘤球的生長(zhǎng)。

綜上，本研究首先通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了聯(lián)合給藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)、腫瘤球生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明聯(lián)合給藥能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。其次，構(gòu)建了乳腺癌異位腫瘤模型，通過(guò)考察腫瘤的生長(zhǎng)抑制、腫瘤組織切片觀察聯(lián)合給藥對(duì)腫瘤的抑制和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡情況，得到了與體外實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)論：阿霉素聯(lián)合蒽貝素能夠顯著提高對(duì)乳腺癌的治療效果。

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（編校：吳茜）

Effect of embelin and doxorubicin on the proliferation of MCF-7 cell and grow th of MCF-7 bearing nudem ice

LIZong-xiang，SUN PingΔ

（Hospital of Central China Agricultural University，Wuhan 430070，China）

ObjectiveTo explore the effect of X-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP）combined with doxorubicin on the proliferation of MCF-7 cell and growth of MCF-7 bearing nude mice.MethodsThe anti-proliferation efficiency of doxorubicin and embelin were determined by MTT assay.MCF-7 cell apoptosis induced by embelin and doxorubicin were detected by Flow cytometry.Anti-tumor ability of embelin and doxorubicin were evalued with tumor spheroids test.MCF-7 cell were xenografted to mice to establish the animal model，which was used to evaluate the effect of antitumor.ResultsCompared with saline group，embelin group and doxorubicin group，the combination（doxorubicin＋embelin）group inhibited the growth of MCF-7 cells effectively（P＜0.01）.The combination group induced the apoptosis of MCF-7 cellsmore effectively than doxorubicin alone（P＜0.01），and significantly inhibit the growth of tumor in vitro and in vivo than other groups（P＜0.01）.ConclusionThe combination of doxorubicin and embelin may be used as a potentially effective treatmentmethod for breast cancer.

doxorubicin；embelin；breast cancer

R737.9

A

1005－1678（2014）04－0005－04

乳腺癌是目前危害婦女健康的主要惡性腫瘤，發(fā)病率占女性惡性腫瘤的25%～30%，并呈逐年上升趨勢(shì)［1-2］。目前，乳腺癌的治療以手術(shù)為主，聯(lián)合化療為輔。然而，以細(xì)胞毒性為主的化學(xué)治療缺乏選擇性，難免產(chǎn)生許多不良反應(yīng)，導(dǎo)致病人對(duì)化療的依從性較差。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）是近年來(lái)備受矚目的一類(lèi)蛋白質(zhì)家族，是一類(lèi)獨(dú)立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些IAPs成員異常高表達(dá)常引起細(xì)胞凋亡受阻，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-5］。X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitorof apoptosis protein，XIAP）是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑。X連鎖凋亡抑制蛋白是腫瘤細(xì)胞內(nèi)抑制凋亡發(fā)生的重要蛋白之一［6］。蒽貝素是一種XIAP的小分子抑制劑，能夠通過(guò)抑制XIAP，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［7-9］。阿霉素是目前臨床上常用的抗腫瘤藥物，已經(jīng)被用于乳腺癌的治療，然而由于其心臟毒性，其應(yīng)用受到一定的限制。本研究將蒽貝素與阿霉素聯(lián)用，旨在探討他們對(duì)乳腺癌的治療作用。

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171365）

李宗祥，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤疾病的基礎(chǔ)與臨床治療，E-mail：lizongxiang1975＠163.com；孫平，通信作者，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤疾病的基礎(chǔ)與臨床治療，E-mail：2094252562＠qq.com。