付桂莉，鄭源泉，盧靜靜，黃美蓮，李延

（1.武漢市兒童醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430016；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430022）

5-氮雜胞苷逆轉(zhuǎn)P16基因甲基化對(duì)血管瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

付桂莉1，鄭源泉1，盧靜靜1，黃美蓮1，李延2

（1.武漢市兒童醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430016；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430022）

目的研究5-氮雜胞苷逆轉(zhuǎn)P16基因甲基化對(duì)血管瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法采用BSP法檢測未處理組和5-氮雜胞苷處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子甲基化情況，RT-PCR和Western Blot分別檢測P16基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，比較2組P16基因啟動(dòng)子甲基化、mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的差異。結(jié)果5-氮雜胞苷處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子第1～13CG位點(diǎn)甲基化率均為0%，明顯低于未處理組細(xì)胞；處理組P16基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著高于未處理組細(xì)胞（P＜0.05）；處理組細(xì)胞吸光度、S期、G2／M期和PI顯著低于未處理細(xì)胞（P＜0.05），G0／G1期和凋亡率顯著高于未處理組細(xì)胞（P＜0.05）。結(jié)論血管瘤細(xì)胞P16基因處于高甲基化和表達(dá)沉默狀態(tài)。5-氮雜胞苷可逆轉(zhuǎn)血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，使沉默的P16基因重新獲得表達(dá)而抑制血管瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

血管瘤；5-氮雜胞苷；P16；甲基化；細(xì)胞增殖；凋亡

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞株購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），胎牛血清（FBS）和 DMEM購自Hyclone公司，MTT試劑購于碧云天公司，DNA提取試劑盒購自Takara；甲基化檢測試劑盒購自北京天漠公司；5-氮雜胞苷購于Sigma；引物合成及測序由華大基因公司完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和5-氮雜胞苷處理 EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞培養(yǎng)基為10%FBS和DMEM，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2無菌培養(yǎng)箱。將細(xì)胞是否采用5-氮雜胞苷處理分為未處理組和處理組。取對(duì)數(shù)增長期EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞，處理組加入5-氮雜胞苷儲(chǔ)存液（終濃度為50 umol／L），孵育12h后用培養(yǎng)基清洗3次，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 P16基因啟動(dòng)子甲基化檢測 采取亞硫酸鹽測序法（Bisulfite Sequencing PCR，BSP）檢測處理和未處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子甲基化，檢測目標(biāo)為P16基因啟動(dòng)子CpG島區(qū)域，包括13個(gè)CG位點(diǎn)。甲基化引物采用Methyl Primer Express Software v1.0設(shè)計(jì)，上游引物序列為 5’-TGGGGTTTTTATAATTAGGAAAGAATAGTT-3’，下游引物序列為5’-AAAACTAAACTCCTCCCCACCTACC-3’。反應(yīng)體系為 25μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min，95℃變性45 s，61℃退火30s，72℃延伸30 s，循環(huán)30個(gè)周期后，最后72℃延伸10min結(jié)束。擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用測序儀測序，測序結(jié)果采用BiQ Analyzer v2.0分析。

圖1 5-氮雜胞苷未處理組（a）和處理組（b）EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子甲基化檢測結(jié)果Fig.1 P16 gene′s promotermethylation in 5-azacytidine untreated EOMA cells（a）and treated EOMA cells（b）

1.4 P16基因表達(dá)檢測 分別提取處理和未處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞總RNA和總蛋白，采用RT-PCR法檢測P16基因mRNA表達(dá)，選擇GAPDH為內(nèi)對(duì)照；采用Western blot法檢測P16基因蛋白質(zhì)表達(dá)，選擇β-actin為內(nèi)對(duì)照。

1.5 細(xì)胞增殖檢測 采用MTT法檢測處理和未處理組細(xì)胞增殖情況，檢測處理前（D0）和處理D1～D7后酶標(biāo)檢測儀檢測490 nm下的吸光值（A），吸光值＝所測吸光度－空白對(duì)照組吸光度。以吸光值為縱坐標(biāo)，時(shí)間（D）為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6 細(xì)胞周期和凋亡檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測處理和未處理組的EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況，其中增殖指數(shù)

2 結(jié)果

2.1 5-氮雜胞苷處理對(duì)P16基因啟動(dòng)子甲基化的影響 未處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子第1CG位點(diǎn)甲基化率為60%、第2～13CG位點(diǎn)甲基化率為80.0%；5-氮雜胞苷處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子第1～13CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%，明顯低于未處理組細(xì)胞（見圖1）。

2.2 5-氮雜胞苷處理對(duì)P16基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因mRNA顯著高于未處理組細(xì)胞（P＜0.05，見圖2）。Western結(jié)果顯示：未處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因蛋白質(zhì)處于低表達(dá)水平狀態(tài)，顯著低于5-氮雜胞苷處理組細(xì)胞（見圖3）。

圖2 未處理和處理組細(xì)胞P16基因mRNA表達(dá)*P＜0.05，與未處理組相比Fig.2 P16 genemRNA expressions in 5-azacytidine treated and untreated EOMA cells*P＜0.05，compared with untreated group

圖3 未處理和處理組細(xì)胞P16基因蛋白質(zhì)表達(dá)*P＜0.05，與未處理組相比Fig.3 Protein expressions of p16 gene in 5-azacytidine treated and untreated EOMA cells*P＜0.05，compared with untreated group

2.3 5-氮雜胞苷處理對(duì)EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞增殖的影響 未處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增殖狀態(tài)，處理組細(xì)胞D1-D7吸光值顯著低于未處理組細(xì)胞D1-D7細(xì)胞吸光值（P＜0.05，見圖4）。

圖4 未處理和處理組EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞增殖曲線Fig.4 Curves of EOMA cell proliferation in 5-azacytidine treated and untreated EOMA cells*P＜0.05，與未處理組對(duì)比，compared with 5-azacytidine untreated group

2.4 5-氮雜胞苷處理對(duì)EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響 5-氮雜胞苷處理組 EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞G0／G1期和凋亡率顯著高于未處理組細(xì)胞（P＜0.05），S期、G2／M期和PI顯著低于未處理組細(xì)胞（P＜0.05，見表1）。

表1 5-氮雜胞苷處理對(duì)EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞周期和凋亡的影響Tab.1 Effect of 5-azacytidine on cell circle and apoptosis of EOMA cell

3 討論

基因表達(dá)異常主要與基因突變和表觀遺傳學(xué)有關(guān)，其中基因表觀遺傳學(xué)修飾是新發(fā)現(xiàn)的與DNA堿基突變無關(guān)的轉(zhuǎn)錄前基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，包括CG甲基化和組蛋白乙?；揎椀龋渲屑谆揎検亲畛Ｒ姷谋碛^遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制［5］。DNA甲基化修飾是在甲基轉(zhuǎn)移酶催化作用下，C結(jié)合甲基形成mC，甲基化的mCpG與DNA甲基結(jié)合蛋白結(jié)合能間接阻遏轉(zhuǎn)錄起始元件與DNA啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合從而調(diào)控基因表達(dá)［6］，基因甲基化異常時(shí)會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞的增殖失去調(diào)控進(jìn)而發(fā)生癌變，越來越多的研究表明其與腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［7］。血管瘤的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，基因甲基化滅活是其中最重要的發(fā)病機(jī)制，獲得證實(shí)的基因包括 KDR［8］、survivin基因［9］和 Tie2受體［10］等。P16是一種抑癌基因，屬于細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶的負(fù)調(diào)控因子，可阻止細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［11-12］。國內(nèi)外的研究已經(jīng)證實(shí)P16基因啟動(dòng)子含有CpG島［13］，其甲基化滅活參與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，基于該事實(shí)，推測P16基因啟動(dòng)子CpG島區(qū)域甲基化可能在血管瘤中具有同樣的角色。本研究采用BSP法檢測正常EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，第1CG位點(diǎn)甲基化率為60%、第2～13CG位點(diǎn)甲基化率為80.0%，表明血管瘤細(xì)胞中P16基因啟動(dòng)子處于高甲基化狀態(tài)，證實(shí)其與血管瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

甲基化中無基因堿基序列改變，故理論上甲基化修飾是可逆的，逆轉(zhuǎn)基因的甲基化理論上可使沉默的基因重新表達(dá)而發(fā)揮功能。5-氮雜胞苷是目前常用的廣譜去甲基化藥物，可使甲基化的mC恢復(fù)為未甲基化的C，使甲基化失活的基因重新獲得表達(dá)［14-15］。本研究中，5-氮雜胞苷處理后的EOMA小鼠血管瘤細(xì)胞P16基因啟動(dòng)子第1～13CG位點(diǎn)甲基化均為0%，mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著高于未處理細(xì)胞，證實(shí)5-氮雜胞苷可完全逆轉(zhuǎn)P16基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)并獲得重新表達(dá)；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，5-氮雜胞苷處理后的細(xì)胞吸光度、S期、G2／M期和PI顯著低于未處理細(xì)胞，G0／G1期和凋亡率顯著高于未處理細(xì)胞，這些證據(jù)表明5-氮雜胞苷對(duì)P16基因啟動(dòng)子的去甲基化可使P16基因重新獲得表達(dá)而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期作用，模擬了P16基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致血管瘤發(fā)生的機(jī)制?；谝陨献C據(jù)，推測5-氮雜胞苷等逆轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子甲基化的藥物是潛在的腫瘤基因靶向治療藥物，值得進(jìn)一步研究。

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（編校：吳茜）

Effects of 5-azacytidine's demethylation for P16 gene on the proliferation and apoptosis of hemangioma cell

FU Gui-li1，ZHENG Yuan-quan1，LU Jing-jing1，HUANGMei-lian1，LIYan2

（1.Department of Dermatology，Wuhan Children's Hospital，Wuhan 430016，China；2.Department of Dermatology，Union Hospital，Tongji Medical college，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China）

ObjectiveTo study the effects of 5-azacytidine's demethylation for P16 gene on hemangioma cell's proliferation and apoptosis.MethodsBisulfite sequencing PCR was applied to detect P16 gene′s promotermethylation status in 5-azacytidine treated and untreated EOMA cell line.RT-PCR and western blotwere used to detect the P16 genemRNA and protein expressions.Flow cytometrywas used to detect cell proliferation，cell cycle and cell apoptosis.The differences of P16 gene′s promotermethylation status，mRNA and protein expressions，cell proliferation，cell cycle and apoptosis in two groupswere compared.ResultsThemethylation rates in 1stand 13th CGswere0%after5-azacytidine treatment in EOMA hemangioma cell line，which were lower than in untreated cells.ThemRNA and protein expressions increased after 5-azacytidine treatment，which were significantly higher than in untreated cells.The absorbance，S phase and G2／Mphase and PIafter 5-azacytidine treatmentwere lower than untreated cells，while the G0／G1 phase and apoptosis rates were higher.ConclusionThe P16 gene promoter is hypermethylated in hemangioma cells with silent gene expressions.5-azacytidine could reverse P16 gene′s promotermethylation and silent gene expressions，which inhibit hemangioma cell's proliferation and promote apoptosis.

Hemangioma；5-azacytidine；P16；methylation；cell proliferation；apoptosis

R733.7

A

1005－1678（2014）04－0015－04

P16是細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶的負(fù)性調(diào)控因子，可阻止細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［1-2］。研究表明，血管瘤組織中P16基因表達(dá)顯著低于正常組織［3］，而基因表達(dá)下降與表觀遺傳學(xué)沉默有關(guān)［4］，推測其可能與P16基因啟動(dòng)子高甲基化有關(guān)。本研究旨在探討5-氮雜胞苷處理和未處理血管瘤細(xì)胞對(duì)其P16基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)、基因表達(dá)和細(xì)胞周期凋亡的變化，研究P16基因去甲基化與血管瘤細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（30901287）

付桂莉，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：E-mail：157047064＠qq.com。