姚紅梅，張璐，張程，葉賢偉，張湘燕，馬麗

（貴州省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體在大鼠肺氣腫中的作用及其與甲強(qiáng)龍干預(yù)的關(guān)系研究

姚紅梅，張璐，張程，葉賢偉，張湘燕，馬麗Δ

（貴州省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

目的觀察抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體（anti-endothelial cells antibodies，AECA）在吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫中的作用，以及甲強(qiáng)龍的干預(yù)影響。方法39只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及甲強(qiáng)龍干預(yù)組（n＝13）。模型組及干預(yù)組進(jìn)行被動(dòng)吸煙，煙霧暴露1個(gè)月時(shí)，對(duì)干預(yù)組皮下注射甲強(qiáng)龍（10mg／kg，1次／d），每周6 d；煙霧暴露90 d后，抽取下腔靜脈血，處死大鼠，同時(shí)收集支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）；檢測(cè)各組大鼠血清、支氣管肺泡灌洗液中的AECA。肺組織切片蘇木素伊紅染色后觀察組織形態(tài)學(xué)改變，測(cè)定肺平均內(nèi)襯間隔（mean linear intercept，MLI）、平均肺泡數(shù)（mean alveolar numbers，MAN）。結(jié)果與正常組、干預(yù)組比較，模型組血清及支氣管肺泡灌洗液中的AECA、MLI升高（P＜0.05），但MAN顯著降低（P＜0.05）；肺泡灌洗液AECA與MLI正相關(guān)（r＝0.821，P＜0.05），與MAN負(fù)相關(guān)（r＝－0.894，P＜0.05）。結(jié)論AECA可能參與吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫形成，并可能與其嚴(yán)重程度相關(guān)；甲強(qiáng)龍可能通過(guò)降低AECA含量影響肺氣腫形成。

肺氣腫；吸煙；抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體；甲強(qiáng)龍；大鼠

血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體（anti-endothelial cells antibodies，AECA）是一組針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)抗原的異質(zhì)性抗體［1］，它可出現(xiàn)在多種自身免疫疾病，如血管炎等。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在終末期肺氣腫病人血清中檢測(cè)到抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體［2］，故推測(cè)，AECA可能在肺氣腫形成中起著重要作用。甲強(qiáng)龍具有強(qiáng)大的抗炎、免疫抑制等作用，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫大鼠模型，驗(yàn)證AECA在肺氣腫發(fā)病中的作用，并觀察與甲強(qiáng)龍干預(yù)的關(guān)系，為完善肺氣腫的發(fā)病機(jī)制及尋求一可能的治療途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠AECA ELISA試劑盒（即用型）（武漢博士德生物工程有限公司）；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（甲強(qiáng)龍，美國(guó)輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)H20080284）；雄獅牌香煙（浙江中煙有限責(zé)任公司，焦油量9mg／盒）

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 煙霧暴露箱（自制）；550酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；DL-5低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（0LYBUS BX41TF，日本）；－80°冰箱（Thermo Fisher Seientific公司，美國(guó)）

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性SD大鼠39只，清潔級(jí)，鼠齡10周，體質(zhì)量為（150±30）g，由重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷(xiāo)售有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）2012－0005。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將39只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、吸煙大鼠肺氣腫模型組、甲強(qiáng)龍干預(yù)組，每組13只。正常對(duì)照組大鼠自由飲水、攝食，無(wú)任何處理。

1.4 飼養(yǎng)條件 所有大鼠飼養(yǎng)于本科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)、采光良好，并定期消毒。3組大鼠在同樣的環(huán)境條件下喂養(yǎng)，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用干凈自來(lái)水，室溫控制在15℃～18℃之間，濕度70%左右。

1.5 動(dòng)物處理及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 肺氣腫模型建立：將模型組放入自制的實(shí)驗(yàn)性大鼠被動(dòng)吸煙箱中，同時(shí)點(diǎn)燃5支香煙，放入箱內(nèi)，至香煙燃燒完全，煙霧基本消失，共計(jì)15min。然后，掀開(kāi)箱蓋，取出大鼠，此為第1次煙霧暴露。休息5min后重復(fù)1次煙霧暴露，清洗煙霧暴露箱。3 h后重復(fù)煙霧暴露。每天煙霧暴露共4次，每周6 d［3］。煙霧暴露達(dá)1個(gè)月時(shí)，以甲潑尼龍琥珀酸鈉（甲強(qiáng)龍）對(duì)干預(yù)組進(jìn)行干預(yù)，13只大鼠吸煙同時(shí)給予甲強(qiáng)龍，按照文獻(xiàn)報(bào)道［4］劑量給藥，藥物經(jīng)生理鹽水溶解，每日上午給予甲強(qiáng)龍（10mg／kg）腹腔內(nèi)注射，每周6 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，第60天時(shí)模型組大鼠死亡1只，第70天時(shí)干預(yù)組死亡1只，第72天時(shí)模型組死亡1只。第90天結(jié)束所有處理并進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.5.2 血清和支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）的收集：各組大鼠終止所有處理后，參照文獻(xiàn)描述的方法［5］，首先將10%水合氯醛麻醉按0.3mL／100g注入大鼠腹腔內(nèi)麻醉大鼠，從下腔靜脈抽取靜脈血，在5℃，2 000 r／min離心10min，分離血清，取上清液（血清）轉(zhuǎn)移至EP管中，作標(biāo)記編號(hào)，置于－70℃冰箱中以備指標(biāo)檢測(cè)。然后，處死大鼠，暴露雙肺與氣管，做一氣管切口，結(jié)扎右主支氣管，連接5mL注射器與尖端磨平的12號(hào)針頭，向左肺注入無(wú)菌生理鹽水3次，每次3mL，收集BALF（回收率為80%～90%），經(jīng)過(guò)濾、離心后，取上清液置入無(wú)菌管內(nèi)，置于－70℃冰箱中備用。

1.5.3 AECA的檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）監(jiān)測(cè)血清及肺泡灌洗液中AECA含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.4 定量分析大鼠肺組織病理切片：結(jié)扎大鼠右中上肺支氣管及左主支氣管，恒壓注入4%多聚甲醛，直至右下肺膨脹、邊緣變銳，約30 min后，取出右下肺，置入4%多聚甲醛，固定24 h。然后行石蠟包埋、切片、脫蠟后進(jìn)行蘇木素伊紅（htoxylin eosin，HE）染色，光鏡下觀察拍照，拍照放大倍數(shù)為100倍，每片隨機(jī)取3個(gè)視野，作形態(tài)分析，每個(gè)視野正中心劃十字交叉線，測(cè)出十字線總長(zhǎng)（L）和每個(gè)視野面積（S），計(jì)算與交叉線相交的肺泡隔數(shù)（number of alveolar septum，NS）和每個(gè)視野內(nèi)肺泡數(shù)（number of alveolar，Na），平均內(nèi)襯間隔（mean linear intercept，MLI）表示肺泡平均內(nèi)徑，MLI＝L／NS，平均肺泡數(shù)（mean alveolar numbers，MAN）反映肺泡密度，MA n＝Na／S。病理讀片拍照均由2名不知情的病理醫(yī)師完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行存儲(chǔ)、整理、分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，各實(shí)驗(yàn)組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊時(shí)用SNK q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊時(shí)用Kruskal-wallis檢驗(yàn)法進(jìn)行組間兩兩比較；采用直線相關(guān)分析分析各組大鼠肺組織肺泡隔數(shù)、肺泡數(shù)與AECA之間的關(guān)系；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 3組大鼠在造模前體質(zhì)量、周齡，活動(dòng)及對(duì)刺激的反應(yīng)均無(wú)顯著差異。模型組在造模期間，毛發(fā)脫落、毛色萎黃、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、牙齒偏黃、呼吸增快；干預(yù)組在單純煙霧暴露期間，出現(xiàn)毛發(fā)脫落、反應(yīng)遲鈍，但在煙霧暴露30 d后予甲強(qiáng)龍10mg／（kg·d）腹腔內(nèi)注射，每周6 d。干預(yù)后，大鼠毛發(fā)、反應(yīng)及活動(dòng)度較前好轉(zhuǎn)；造模結(jié)束后，正常組大鼠毛發(fā)、牙齒、活動(dòng)等一般指標(biāo)與造模前相比無(wú)顯著變化。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組大鼠第60天時(shí)死亡1只，干預(yù)組第70天時(shí)死亡1只，模型組第72天時(shí)死亡1只，原因均不清，正常組無(wú)動(dòng)物死亡。

2.2 各組大鼠肺組織HE染色切片病理學(xué)變化 顯微鏡下，正常大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔完整，氣管壁結(jié)構(gòu)清楚，氣管內(nèi)表面纖毛豐富、整齊，未見(jiàn)脫落現(xiàn)象。模型組及甲強(qiáng)龍干預(yù)組大鼠支氣管肺內(nèi)見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖毛脫落、倒?fàn)睿瓲钌掀ぜ?xì)胞化生，肺泡壁變薄甚至斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大泡；在上述變化中，干預(yù)組較模型組相對(duì)較輕（見(jiàn)圖1）。與正常組比較，模型組大鼠MLI明顯增加，MAN明顯減小，表現(xiàn)為明顯的肺氣腫樣改變，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，干預(yù)組大鼠MLI明顯減小，MAN明顯增加（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果（×100）Fig.1 Staining Results in different groups（×100）

表1 3組大鼠平均內(nèi)襯間隔（MLI）及平均肺泡數(shù)（MAN）比較Tab.1 The comparison of MLIand MAN among groups

2.3 各組大鼠血清及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中 AECA含量的比較 模型組BALF及血清中AECA含量高于正常組（P＜0.05），與模型組比較，干預(yù)組BALF及血清中AECA含量均顯著降低（P＜0.05，見(jiàn)表2）。模型組及治療組肺泡灌洗液AECA與 MLI正相關(guān)，（r＝0.821，P＜0.05），與MAN負(fù)相關(guān)（r＝－0.894，P＜0.05）。正常組肺泡肺泡灌洗液 AECA與 MLI、MAN均無(wú)相關(guān)性。

表2 各組大鼠AECA含量的比較（ng／L）Tab.2 The comparison of AECA among groups（ng／L）

3 討論

慢性阻塞性肺疾病簡(jiǎn)稱(chēng)慢阻肺，它是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，病理改變包括慢性支氣管炎、肺氣腫等。本實(shí)驗(yàn)在建立肺氣腫模型過(guò)程中，正常組大鼠一般指標(biāo)正常，無(wú)動(dòng)物死亡。而模型組大鼠在煙霧暴露過(guò)程中，出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)脫落，并在煙霧暴露過(guò)程中出現(xiàn)大鼠死亡。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似［6-7］。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠肺內(nèi)組織病理檢查發(fā)現(xiàn)：模型組肺組織出現(xiàn)肺氣腫樣改變，如肺泡壁破壞、肺泡腔擴(kuò)大等，與國(guó)內(nèi)張程等［8］研究結(jié)果一致，表明吸煙肺氣腫模型復(fù)制成功。

本實(shí)驗(yàn)采用吸煙肺氣腫大鼠模型為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)模型組血清及肺泡灌洗液中AECA的濃度較正常組明顯升高，提示ACEA可能參與吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫發(fā)生。吸煙是導(dǎo)致慢阻肺的最重要因素之一，香煙中含有約4700外源性化合物，而在某種條件下，包含有害物質(zhì)和潛在免疫原性［8-9］，這些外源性化合物可在肺內(nèi)沉積，并且誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，包括自身抗體產(chǎn)生［10］。

AECA是一組針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)抗原的異質(zhì)性抗體［11］。AECA的抗原是一簇位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的異質(zhì)性蛋白，該抗體可出現(xiàn)在多種自身免疫病當(dāng)中，近幾年，自身免疫機(jī)制已經(jīng)被確認(rèn)為是慢阻肺發(fā)病機(jī)制之一［3，12-14］。目前國(guó)外相關(guān)研究［15］對(duì)自身免疫性肺氣腫動(dòng)物的研究則進(jìn)一步提示AECA可能和自身免疫性肺氣腫形成相關(guān)。但在吸煙肺氣腫動(dòng)物中AECA對(duì)肺氣腫的發(fā)生有無(wú)影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

有研究表明［16］慢阻肺患者血清中發(fā)現(xiàn)AECA的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)慢阻肺患者較正常對(duì)照人群血清AECA水平顯著增高，而在非慢阻肺患者或不吸煙患者中，該水平呈低表達(dá)或不表達(dá)。因此推測(cè)AECA在吸煙導(dǎo)致的肺氣腫中可能也有一定的作用，而且可能和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠肺泡灌洗液中ACEA與肺平均內(nèi)襯間隔成正相關(guān)、平均肺泡數(shù)成負(fù)相關(guān)，更進(jìn)一步支持ACEA參與了肺氣腫的發(fā)生。本研究未發(fā)現(xiàn)血清中AECA與平均內(nèi)襯間隔及平均肺泡數(shù)有明顯的相關(guān)性，這可能與血清中AECA的影響因素較多有關(guān)。

甲強(qiáng)龍具有強(qiáng)大的抗炎、免疫抑制等作用，較多研究表明伴隨有AECA升高的自身免疫性疾病對(duì)皮質(zhì)醇類(lèi)固醇治療反應(yīng)良好，而大量的臨床事實(shí)證明慢阻肺急性加重期患者在標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上加糖皮質(zhì)激素可緩解癥狀，減慢肺功能下降［17］。本研究發(fā)現(xiàn)甲強(qiáng)龍干預(yù)組AECA較模型組顯著降低，說(shuō)明甲強(qiáng)龍可能通過(guò)干預(yù)AECA表達(dá)，而對(duì)肺氣腫起一定治療作用。

吸煙可引起氣道炎癥、刺激副交感神經(jīng)、氧自由基產(chǎn)生增多、誘導(dǎo)自身免疫等等多環(huán)節(jié)導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生，本研究結(jié)果表明，AECA在吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫發(fā)病中有重要意義，甲強(qiáng)龍可能通過(guò)降低AECA而對(duì)肺氣腫有一定的治療作用。但本研究?jī)H初步觀察了AECA與吸煙肺氣腫以及甲強(qiáng)龍干預(yù)的影響，尚未對(duì)其可能的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討。

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（編校：譚玲）

Effects of anti-endothelial cell antibody（AECA）and intervention of methylprednisolone in emphysema rats

YAO Hong-mei，ZHANG Lu，ZHANG Cheng，YE Xian-wei，ZHANG Xiang-yan，MA LiΔ

（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，People's Hospital of Guizhou，Guiyang 550002，China）

ObjectiveTo explore the effects and mechanisms of anti-endothelial cell antibody（AECA）in the alveolar cell apoptosis of the emphysema rats induced by smoking，and to discuss the intervention effects of methylprednisolone.Methods39 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal controlgroup，modelgroup，and intervention group，with 13 rats in each group.Emphysemamodelswere established in the latter two groups.After exposing to cigarette smoking for onemonth，methylprednisolone injected intraperitoneally in the intervention group（10mg／kg，1 time／d），6d／week.On the 90th day，inferiora vena cave blood sampleswere collected and all ratswere sacrificed.The levels of AECA were detected in bronchial alveolar lavage fluid（BALF）and serum，respectively.Pathological changes were observed in lung tissues stained by hematoxylin eosin，quantitative determination of lung averagemean linear intercept（MLI）and mean alveolar number（MAN）were preformed.ResultsCompared with normal group and intervention group，the levels of AECA in BALF and serum，MLI in themodel group were higher（P＜0.05），but the levels ofMAN was lower（P＜0.05）；There is a positive correlation between AECA in BALF and MLI of rats（r＝0.821，P＜0.05），a negative correlation between AECA in BALF and MAN（r＝－0.894，P＜0.05.Conclusions ACEAmay enroll the pathogenesisofemphysema in rats induced by smoking and related with the severity.Methylprednisolonemay inhibit the formation of emphysema by reducing the expression level of AECA in airway.

emphysema；smoke；anti-endothelial cells antibodies；methylprednisolone；rats

R363

A

1005－1678（2014）04－0008－04

慢性阻塞性肺疾病簡(jiǎn)稱(chēng)慢阻肺，其病理變化主要包括慢支炎、肺氣腫等，是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病，病死率較高，發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，治療效果不盡人意，越來(lái)越多的研究表明，自身免疫反應(yīng)在肺氣腫甚至慢阻肺的形成過(guò)程中具有重要的作用，被認(rèn)為是慢阻肺發(fā)病的新機(jī)制。

國(guó)家自然科學(xué)基金（81060006）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金黔科合J字［2011］2251；十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2013BAI09B09）

姚紅梅，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：慢性氣道疾病，E-mail：yaohmok＠126.com；馬麗，通信作者，女，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病，E-mail：maligy＠126.com。