于峰，邸彥橙，姜麗麗

（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院泌尿外科，黑龍江牡丹江157011）

槲皮素對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞HSP27 m RNA表達(dá)和凋亡的影響

于峰，邸彥橙，姜麗麗

（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院泌尿外科，黑龍江牡丹江157011）

目的評(píng)價(jià)槲皮素對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞熱休克蛋白27（HSP27）mRNA表達(dá)和凋亡的影響，初步探討槲皮素抗前列腺癌的可能作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組；陰性對(duì)照組：給予二甲亞砜（DMSO）；高劑量組：給予0.6mg／mL槲皮素150μL；低劑量組：給予0.3mg／mL槲皮素150μL。采用RT-PCR和免疫熒光染色檢測(cè)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)情況；采用TUNEL檢測(cè)給予槲皮素后PC-3細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果RT-PCR檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組PC-3細(xì)胞的HSP27 mRNA表達(dá)水平分別為128%、110%、50%和60%，2給藥組與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。免疫熒光染色結(jié)果顯示，槲皮素可明顯降低HSP27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度；TUNEL結(jié)果顯示，給藥組可見(jiàn)大量PC-3細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論槲皮素可抑制HSP27 mRNA的表達(dá)和誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，這可能是其抗前列腺癌的機(jī)制之一。

槲皮素；前列腺癌；熱休克蛋白27；細(xì)胞凋亡

熱休克蛋白（HSP）作為分子伴侶廣泛存在于原核與真核細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)控以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等重要的生物學(xué)過(guò)程，是生物體內(nèi)具有廣泛和重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)［1］。Fuller等［2］研究發(fā)現(xiàn)，HSP和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫，抗腫瘤治療以及腫瘤的預(yù)后等關(guān)系密切。HSP27是HSP亞家族成員之一，在多種腫瘤細(xì)胞中均有過(guò)表達(dá)，其主要的生物學(xué)功能是防止各種應(yīng)激因素對(duì)細(xì)胞的損傷。另外，HSP27還與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)［3］。目前HSP27與腫瘤的關(guān)系日益受到重視，但是有關(guān)HSP27在前列腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中所起的作用仍存在爭(zhēng)議。前列腺癌（prostatic cancer）是歐美地區(qū)男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率有逐漸增高趨勢(shì)［4］。美國(guó)前列腺癌發(fā)病率占男性腫瘤發(fā)病率的第二位，僅次于肺癌［5］。中國(guó)前列腺癌發(fā)病率雖然低于歐美國(guó)家，但是近年來(lái)呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。有研究證實(shí)，黃酮、多酚類化合物被認(rèn)為是預(yù)防治療前列腺癌很有潛力的藥物。槲皮素（quereetin）是一種黃酮類化合物，在自然界中廣泛存在，除具有多種生物學(xué)活性，大量體內(nèi)外研究證實(shí)，槲皮素具有抗感染、抗氧化、清除氧自由基和抗腫瘤等多種作用外［6］，還可通過(guò)多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡等，發(fā)揮抗腫瘤活性［7］，在臨床上是非常有應(yīng)用價(jià)值和前景的抗腫瘤藥物。本研究旨在評(píng)價(jià)槲皮素對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞HSP27mRNA表達(dá)和凋亡的影響，初步探討槲皮素抗前列腺癌的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 槲皮素購(gòu)自Sigma公司，純度98%。使用二甲亞砜（DMSO）分別配制成0.3mg／mL（半數(shù)有效量［8］）和0.6mg／mL溶液，－20℃冰箱保存，備用。

1.2 細(xì)胞株 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司，分為4組：空白對(duì)照組；陰性對(duì)照組：DMSO；槲皮素高劑量組：給予0.6mg／mL槲皮素150μL；槲皮素低劑量組：給予0.3mg／mL槲皮素150μL。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與給藥 PC-3細(xì)胞株保存在含有10%胎牛血清的F12營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（含青霉素100 U／mL和鏈霉素100μg／mL）。按照細(xì)胞密度1×106個(gè)／孔接種于6孔板中，37℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后分為4組：空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，槲皮素高劑量組，槲皮素低劑量組。待80%細(xì)胞融合后，更換新鮮培養(yǎng)液，分別加入0.6、0.3mg／mL槲皮素150μL，空白對(duì)照組不給藥，陰性對(duì)照組給予等體積DMSO。收集培養(yǎng)液用于后續(xù)分析。

1.4 RT-PCR檢測(cè)PC-3細(xì)胞HSP27mRNA的表達(dá) 按照說(shuō)明書(shū)，TRIzol試劑盒抽提總RNA，溶于20μL DEPC-H2O，依次加入2.5μL DNA酶，2.5μL 10×buffer，37℃水浴30min后，65℃水浴10min，分光光度法檢測(cè)RNA濃度。HSP27 PCR引物是：5′-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3′（正向）和5′-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3′（反向），GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物：5′-GGTCAACGGGTAGGTGTTTG-3′（正向）和5′-GCCTTTGGGCTCTGCATGAA-3′（反向）。HSP27 PCR反應(yīng)總體積25μL。使用GeneAmp 2400熱循環(huán)儀，預(yù)變性94℃5min，變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳（110V，35mA，30min），溴化乙錠染色，BandScan 5.0軟件進(jìn)行電泳結(jié)果吸光度積分值分析，HSP27 mRNA表達(dá)相對(duì)含量值（灰度比）＝HSP27吸光度積分值／GAPDH吸光度積分值。

1.5 PC-3細(xì)胞免疫熒光染色 常規(guī)方法收獲細(xì)胞，胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，PBS沖洗后，TCM-N3沖洗，50mL錐形管2000 r／min離心10min。將上清液吸出并重新懸浮于1mL TCM-N3，滴于載玻片（多聚賴氨酸包被）上吹干，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌5min，共5次。滴加5 g／L BSA封閉液，37℃封閉30min，加入相應(yīng)的一抗兔抗小鼠HMGBl抗體（1∶200），PBS洗滌5min，共5次。加入熒光標(biāo)記的二抗PE標(biāo)記的驢抗兔IgG（1∶500），避光，37℃孵育2 h，PBS洗滌5min，共5次。Hoechst 33342染料避光37℃孵育15min，PBS洗滌，共3次。緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察、拍照并保存。

1.6 TUNEL檢測(cè)PC-3細(xì)胞凋亡 使用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)槲皮素對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響。將細(xì)胞用PBS沖洗，－20℃甲醇固定15min，然后PBS沖洗細(xì)胞3次，加入50μL TUNEL反應(yīng)液，避光37℃孵育1 h。PBS沖洗細(xì)胞，Hoechst33258染料37℃染色10min。凋亡指數(shù)＝TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)的影響 RTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組PC-3細(xì)胞的HSP27 mRNA表達(dá)水平明顯升高，分別為128%和110%；給予槲皮素干預(yù)后，PC-3細(xì)胞的HSP27 mRNA表達(dá)水平明顯降低，分別為50%和60%，并且槲皮素高劑量組降低更加明顯，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖1）。

圖1 槲皮素對(duì)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)的影響*P＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.1 Effect of quereetin on the HSP27 mRNA expression*P＜0.05，compared with the control group

2.2 PC-3細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組HSP27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯高于槲皮素治療組，并且槲皮素高劑量組HSP27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度降低更加明顯（見(jiàn)圖2）。

圖2 PC-3細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果（×400）Fig.2 Immunofluorescent staining results of PC-3 cell（×400）

2.3 槲皮素對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響 槲皮素高劑量組和低劑量組可見(jiàn)大量凋亡PC-3細(xì)胞，且高劑量組高于低劑量組，呈劑量依賴性，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖3）。

圖3 槲皮素誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡（SP，×200）*P＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.3 PC-3 cell apoptosis induced by quereetin（SP，×200）*P＜0.05，compared with control group

3 討論

HSP是應(yīng)激條件下產(chǎn)生的高度保守的分子伴侶［9］，是組織和器官受到刺激或應(yīng)激時(shí)表達(dá)的主要蛋白質(zhì)，可參與細(xì)胞損傷、防御、修護(hù)產(chǎn)生而控制細(xì)胞功能［10］。HSP27作為小HSP亞家族中的重要一員，近年來(lái)研究HSP27與腫瘤的關(guān)系成為熱點(diǎn)。正常組織細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)水平很低。應(yīng)激狀態(tài)可致胞內(nèi)HSP27磷酸化并致其寡聚體解聚，HSP27表達(dá)上調(diào)，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲以及轉(zhuǎn)移過(guò)程［11］。本研究結(jié)果顯示空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組HSP27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯增高。研究結(jié)果與其相一致。

槲皮素是一種具有多種生物活性且無(wú)明顯毒副作用的黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜及水果中，具有抗腫瘤、抗氧化、清除氧自由基、抗感染、抗血栓和抗病毒等多種活性，特別是抗腫瘤作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)并引起廣泛的重視［4，12］。然而槲皮素對(duì)前列腺癌的作用知之甚少。故此，本研究旨在討論槲皮素對(duì)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制HSP27mRNA的表達(dá)，而且隨著劑量增加，抑制作用增強(qiáng)，具有劑量依賴性。另外還發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)PC-3細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用。槲皮素抑制PC-3細(xì)胞HSP27mRNA的表達(dá)和誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡可能是其抗前列腺癌的機(jī)制之一。

綜上所述，PC-3細(xì)胞HSP27mRNA表達(dá)水平明顯增高，而槲皮素可以抑制PC-3細(xì)胞HSP27mRNA表達(dá)，高濃度的槲皮素抑制作用更強(qiáng)，為尋找治療治療靶位奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，槲皮素還誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，然而槲皮素誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制有待深入研究。

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（編校：譚玲）（編校：吳茜，劉路路）

Effect of quereetin on the expression of HSP27 mRNA and apoptosis of human prostate cancer PC-3 cell

YU Feng，DIYan-cheng，JIANG Li-li

（Department of Urinary Surgery，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China）

ObjectiveTo evaluate the effectof quereetin on the expression of HSP27 mRNA and apoptosis of human prostate cancer PC-3 cell and discuss themechanism of quereetin on prostate cancer.MethodsHuman prostate cancer PC-3 cells were cultured and randomly divided into four groups：blank control group，negative control group（dimethylsulfoxide，DMSO group），high dose group（0.6 mg／mL quercetin 150μL），low dose group（0.3mg／mL quercetin 150μL）.RT-PCR and immunofluorescence staining were performed to detect the HSP27 mRNA expression，and the TUNEL staining was used to analyse the PC-3 cell apoptosis after quercetin treatment.ResultsRT-PCR results showed HSP27 mRNA expression was respectively 128%，110%，50%and 60%in four groups and displayed dose dependent manner.The difference between blank control group and quercetin treatment groups was statistically significant（P＜0.05）.Immunofluorescence staining showed quercetin could decrease the intensity of HSP27.TUNEL staining displayed large amountof apoptotic cells in quercetin treatment groups and showed dose dependentmanner.Compared with the blank control group，the differencewas statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Quercetin could inhibit PC-3 cell HSP27 expression and induce cell apoptosis，such effectsmay be onemechanism of its anti-prostate cancer.

quereetin；prostate cancer；heat shock protein 27；cell apoptosis

R585.5

A

1005－1678（2014）08－0047－03

于峰，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：泌尿外科疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：yufeng80＠126.com。