汪治宇，李幸，郭曉金，邢聯(lián)萍，劉雅，單保恩Δ

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤免疫科，河北石家莊050011；2.美國(guó)羅切斯特大學(xué)病理科，美國(guó)羅切斯特14624）

NEDD4-l對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞TrkA泛素化的影響

汪治宇1，李幸1，郭曉金1，邢聯(lián)萍2，劉雅1，單保恩1Δ

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤免疫科，河北石家莊050011；2.美國(guó)羅切斯特大學(xué)病理科，美國(guó)羅切斯特14624）

目的檢測(cè)前列腺癌PC3細(xì)胞中泛素連接酶NEDD4-l（neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1，NEDD4-1）對(duì)酪氨酸蛋白激酶A（tyrosine kinase A，TrkA）泛素化作用的研究，探討NEDD4-l調(diào)節(jié)前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲及遷移的機(jī)制。方法采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將NEDD4-l質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入前列腺癌PC3細(xì)胞中，應(yīng)用蛋白免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）結(jié)合免疫印跡（immunoblotting，IB）法，觀察外源的NEDD4-l和TrkA的相互作用；共表達(dá)NEDD4-l和ubiquitin，用Co-IP結(jié)合IB法檢測(cè)NEDD4-1對(duì)TrkA的泛素化作用；共表達(dá)NEDD4-l和ubiquitin的同時(shí)，用蛋白酶體抑制劑MG132處理，觀察TrkA水平的改變。結(jié)果轉(zhuǎn)染NEDD4-1質(zhì)粒后，外源性表達(dá)的NEDD4-l可與TrkA共沉淀；共表達(dá)NEDD4-1和ubiquitin后，NEDD4-1對(duì)內(nèi)源的TrkA有泛素化作用，TrkA能與泛素共沉淀；共表達(dá)NEDD4-1和ubiquitin，用蛋白酶體抑制劑MGl32處理后，TrkA的泛素化降解被抑制。結(jié)論在前列腺癌PC3細(xì)胞中，TrkA是NEDD4-1的底物之一；NEDD4-1可調(diào)節(jié)TrkA的泛素化作用，促進(jìn)其在蛋白酶體降解。

前列腺癌；NEDD4-1；TrkA；泛素化

前列腺癌是目前全球男性致死率排名第2位的腫瘤［1］，隨著直腸指檢、PSA分析、超聲醫(yī)學(xué)等技術(shù)的應(yīng)用，其篩出率逐年增高。因此，闡明其發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療手段成為現(xiàn)代神經(jīng)外科的研究熱點(diǎn)之一。

近年來(lái)，蛋白泛素化降解在腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用越來(lái)越受到人們的重視［2］。蛋白的泛素化（ubiquitination）降解是指在泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）及泛素連接酶（E3）的依次作用下將多個(gè)泛素（ubiquitin）共價(jià)結(jié)合到特定的靶蛋白上，并被帶到26S蛋白酶體降解的過(guò)程［3］。在多泛素化過(guò)程中，底物特異性由E3決定，因此E3是蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程重要的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，也是研究熱點(diǎn)，其中，泛素連接酶NEDD4-l（neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1，NEDD4-1）是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一［3-4］。NEDD4-1最早是由Kumarts等［5］發(fā)現(xiàn)的HECT（homologous to E6-APC-terminus）泛素連接酶，NEDD4-l包括一個(gè)N端的C2（Ca2＋／lipid-binding）結(jié)構(gòu)域，中間的4個(gè)WW結(jié)構(gòu)域及一個(gè)C端的HECT結(jié)構(gòu)域，C2參與膜靶向結(jié)合，WW參與蛋白質(zhì)的相互作用以及底物識(shí)別，HECT具有E3的催化活性，負(fù)責(zé)靶蛋白的泛素化和降解［4，6］。研究顯示NEDD4-1可以與多種底物相互作用，現(xiàn)已鑒定的底物有：①離子通道和膜載體；②膜受體；③腫瘤抑制基因；④胞吞的蛋白［7-8］。因此，NEDD4與下列多種生物效應(yīng)有關(guān)：神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)［9］，腫瘤發(fā)生與細(xì)胞生長(zhǎng)［10］，細(xì)胞代謝［11］，受體的胞吞與降解，病毒的出芽［12］。NEDD4-1優(yōu)先泛素化腫瘤抑制基因和胞吞的蛋白［13］。于如同等［14-15］研究發(fā)現(xiàn)，用NEDD4-1的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染PTEN缺失的U251和U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率明顯升高，侵襲性降低；而過(guò)表達(dá)NEDD4-1則促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲。

酪氨酸蛋白激酶A（tyrosine kinase A，TrkA）是神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）的高親和力功能性受體，NGF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)作用必須與TrkA受體相結(jié)合才能得以實(shí)現(xiàn)［16-17］。而正常成年大鼠腦組織內(nèi)僅有少數(shù)神經(jīng)元表達(dá)TrkA。出血性腦損傷后，如何提高TrkA受體表達(dá)，對(duì)維持損傷神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷后的存活及修復(fù)，重建神經(jīng)生理功能具有重要意義。TrkA是相對(duì)分子質(zhì)量為140 kD的酪氨酸PK受體，其分子組成可以分為3個(gè)部分，即辨別并結(jié)合NGF的膜外部、跨膜部和由酪氨酸激酶產(chǎn)生酶活性的胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)含有 2個(gè)LRRs，具有識(shí)別并結(jié)合NGF的功能，胞內(nèi)區(qū)有酪氨酸激酶以及結(jié)合src癌基因同源2（src homology domain，SH2）、PLC-yl的位點(diǎn)［18］，激酶部分是TrkA的催化部位，酪氨酸殘基是TrkA關(guān)鍵的功能部位。相關(guān)研究結(jié)果分析Slitrk家族具有與TrkA類(lèi)似的胞內(nèi)區(qū)，其胞內(nèi)區(qū)酪氨酸殘基也是潛在的磷酸化位點(diǎn)，并且Slitrk調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)的作用機(jī)制與TrkA相似［19］。

已有文獻(xiàn)報(bào)道在PC12細(xì)胞中，NEDD4可以將TrkA泛素化［20］。目前在前列腺癌中關(guān)于NEDD4-1和TrkA間作用的研究未見(jiàn)有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬采用體外前列腺癌PC3細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)免疫印記、免疫共沉淀等技術(shù)檢測(cè)NEDD4-1與TrkA蛋白間的相互作用機(jī)制；并用蛋白酶體抑制劑處理，觀察處理前后對(duì)TrkA蛋白水平的影響，進(jìn)而為前列腺癌細(xì)胞侵襲、遷移的基因基礎(chǔ)尋找到新的信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 材料 pcDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒由美國(guó)Memorial Sloan-Kettering腫瘤中心細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Xuejun Jiang教授饋贈(zèng)。HA-ubiquitin質(zhì)粒由中國(guó)社會(huì)科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所饋贈(zèng)。前列腺癌PC3細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DH5a大腸桿菌購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。牛血清白蛋白（Amresco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM／F12（Gibco公司），MGl32蛋白酶體抑制劑（MERCK-Calbiochem公司），Ampicillin（上海生物工程有限公司），lipofectamine 2000（Invitrogen公司）。細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿（Coming公司），質(zhì)粒抽提試劑盒（Invitrogen公司），PVDF膜（Milipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3培養(yǎng)在10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基（含100 U／m L青霉素）中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，棄掉培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化，每隔2～3 d分瓶傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞1× 106個(gè)，加入DMEM／F12完全培養(yǎng)基2mL繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到約80%的融合度時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液，2 h時(shí)后用脂質(zhì)體（lipofectamine 2000）進(jìn)行轉(zhuǎn)染：將10μL lipofectamine 2000加入250μL opti-MEM中，混勻；將4μg pcDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒加入250μL opti-MEM中，混勻；然后將稀釋好的lipofectamine 2000和質(zhì)粒輕柔混勻，室溫孵育20min；把孵育好的混合物均勻加入細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 蛋白免疫印跡法 收集轉(zhuǎn)染48 h的PC3細(xì)胞，每個(gè)10 cm培養(yǎng)皿加1mL的NP40裂解緩沖液冰上裂解30min。進(jìn)行離心（4℃，12000 r／min，30min）。收集上清液蛋白，－80℃保存?zhèn)溆谩?0μg蛋白行SDS-PAGE電泳，以濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶室溫封閉1 h，TBST洗膜（5min×5）；一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST再次洗膜（5min×5）加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，室溫2 h，TBST洗膜（5min×5）；ECL發(fā)光。以等量蛋白質(zhì)上樣β-actin對(duì)照，分析條帶的灰度值與各自的內(nèi)參β-actin的比值來(lái)判斷目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.3 免疫共沉淀結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測(cè)NEED4-1與TrkA相互作用 將上述－80℃保存的上清液蛋白，用分光光度計(jì)進(jìn)行比色分析測(cè)定蛋白濃度。留取2個(gè)500μg蛋白行免疫共沉淀。將每組蛋白樣品加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液至1 mL，分別加入2μg相應(yīng)的單克隆抗體（沉淀NEDD4-1用NEDD4-1抗體，陰性對(duì)照組加入抗體兔IgG），4℃轉(zhuǎn)轱24 h；再加入30μL Protein G Agarose，4℃轉(zhuǎn)轱24 h，用NP40裂解液洗Protein G Agarose 5次，最后加入30μL 2×SDS上樣緩沖液懸起混勻；煮沸10min，使蛋白充分變性，離心（4℃，2000 g，15min），將上清行免疫印記檢測(cè)。如1.2.2所示步驟進(jìn)行免疫印跡，分為3組（見(jiàn)表1）：Input組上樣量為50μg，其余2組將免疫共沉淀產(chǎn)物上清全部加入上樣孔。

表1 免疫印跡實(shí)驗(yàn)分組Tab.1 Grouping of IB

1.2.4 檢測(cè)NEDD4-l對(duì)內(nèi)源的TrkA的泛素化 共表達(dá)NEDD4-1和ubiquitin用蛋白免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)合免疫印跡（IB）法，檢測(cè)NEDD4-l對(duì)內(nèi)源的TrkA的泛素化作用。如前面所示步驟，單獨(dú)或者同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NEDD4-l質(zhì)粒和HA-ubiquitin質(zhì)粒至PC3細(xì)胞中，然后進(jìn)行蛋白免疫共沉淀和免疫印跡。免疫印跡分為3組（見(jiàn)表2）。

表2 免疫印跡實(shí)驗(yàn)分組Tab.2 Grouping of IB

1.2.5 免疫印跡（IB）觀察TrkA水平的改變 共表達(dá)NEDD4-1和ubiquitin，用蛋白酶體抑制劑MGl32處理，用免疫印跡（IB）觀察TrkA水平的改變，反映其降解情況。每孔質(zhì)粒DNA lμg，脂質(zhì)體2.5μL。轉(zhuǎn)染后5 h換液，轉(zhuǎn)染32 h取出一組4孔加入10μM蛋白酶抑制劑MGl32，每孔加入20 mg／mL的 MGl32 0.118μL，其終濃度為10μM。處理16 h，然后用NP40細(xì)胞裂解液（已加蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞。如上述步驟所示，進(jìn)行免疫印跡分組（見(jiàn)表3）。

表3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)分組Tab.3 Grouping of IB

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌PC3細(xì)胞過(guò)表達(dá)NEDD4-1后，外源性NEDD4-可以和內(nèi)源性TrkA共沉淀 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA 3.1-NEDD4-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PC3細(xì)胞后48 h，應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：NEED4-1可與內(nèi)源性TrkA共沉淀，IgG抗體對(duì)照組則無(wú)共沉淀現(xiàn)象（見(jiàn)圖1）。

圖1 外源性NEDD4-1與內(nèi)源性TrkA可以共沉淀Fig.1 Endogenous TrkA co-precipitated with exogenous NEDD4-1

2.2 共表達(dá)NEDD4-1和ubiquitin，NEDD4-1對(duì)內(nèi)源的TrkA有泛素化作用，TrkA能與泛素共沉淀 將pcDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒和HA-ubiquitin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入PC3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖2）：HA-ubiquitin與內(nèi)源性TrkA可以共沉淀，IgG抗體對(duì)照組沒(méi)有共沉淀現(xiàn)象，提示NEDD4-1對(duì)內(nèi)源的TrkA有泛素化作用。共表達(dá)NEDD4-1和ubiquitin，NEDD4-1對(duì)內(nèi)源的TrkA有泛素化作用，TrkA能與泛素共沉淀。用HA-ubiquitin質(zhì)粒和／或不和pcDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測(cè)ubiquitin與內(nèi)源性TrkA可以共沉淀（lane 1，2，5，6），IgG抗體對(duì)照組沒(méi)有共沉淀現(xiàn)象（lane 3，4），NEDD4-1對(duì)內(nèi)源的TrkA有泛素化作用（lane 6）：泛素化的TrkA可以用HA抗體檢測(cè)（1anes 1，2，5，6）；過(guò)表達(dá)外源性泛素可以用HA抗體檢測(cè)（lane 1～6）。

圖2 外源性泛素可以與內(nèi)源性TrkA共沉淀Fig.2 Exogenous ubiquitin co-precipitated with endogenous TrkA

2.3 共表達(dá)NEDD4-1和ubiquitin后，用蛋白酶體抑制劑MGl32處理，TrkA的泛素化降解作用能夠被抑制 將 pcDNA3.1-NEDD4-1和HA-ubiquitin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251細(xì)胞，轉(zhuǎn)染32 h后，再用蛋白酶體抑制劑MGl32處理16 h，免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，共表達(dá)NEDD4-l和ubiquitin（共轉(zhuǎn)染組），TrkA蛋白的表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；MGl32處理后，這一差異消失，說(shuō)明共轉(zhuǎn)染組對(duì)TrkA泛素化降解作用能夠被抑制（見(jiàn)圖3）。

圖3 外源性NEDD4-1介導(dǎo)TrkA泛素化降解**P＜0.01，與對(duì)照相比Fig.3 Exogenous NEDD4-1 regulates ubiquitination of TrkA **P＜0.01，compared with control group

3 討論

常規(guī)檢測(cè)目的蛋白相互作用的方法是免疫共沉淀技術(shù)，該技術(shù)是一種微量、靈敏和特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于腫瘤、酶與病毒、寄生蟲(chóng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等蛋白質(zhì)相互作用的研究中，已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)相互作用的一個(gè)可靠技術(shù)［21］。

本研究應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合免疫印跡技術(shù)可以檢測(cè)到內(nèi)源性TrkA可以被結(jié)合了NEDD4-1抗體的瓊脂糖珠子（protein G-Agarose beads）沉淀下來(lái)，而對(duì)照抗體兔IgG卻不能出現(xiàn)共沉淀。說(shuō)明NEDD4-1和TrkA 2種蛋白質(zhì)是存在相互作用的。

為了進(jìn)一步證實(shí)NEDD4-1是否介導(dǎo)了TrkA的泛素化作用。用HA-ubiquitin質(zhì)粒與pcDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒一起或單獨(dú)轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，觀察TrkA的泛素化現(xiàn)象。用免疫共沉淀結(jié)合免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)到TrkA可以與結(jié)合了HA抗體的瓊脂糖珠子共同沉淀下來(lái)，而對(duì)照抗體卻沒(méi)有沉淀現(xiàn)象出現(xiàn)。NEDD4-1蛋白也可以一起被沉淀下來(lái)，但是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所用的pcDNA3.1質(zhì)粒載體上也帶有HA-tag，所以雖然被沉淀下來(lái)，但不能肯定的說(shuō)是3者共沉淀的，當(dāng)然也存在3者共沉淀的可能性，而且理論上也應(yīng)該是3者共沉淀。

泛素化過(guò)程的最終是要進(jìn)入泛素-蛋白酶體通路進(jìn)行降解［22］。為了探討應(yīng)用蛋白酶體抑制劑是否能阻止TrkA泛素化降解。采用HA-ubiquitin質(zhì)粒與pcDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒一起或單獨(dú)轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染32 h后，參考相關(guān)文獻(xiàn)方法［23］，取出一組用10μM蛋白酶體MGl32處理16 h，免疫印記技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染組TrkA被泛素化降解，而用10μM蛋白酶體MGl32處理16 h組泛素化降解被抑制。本文結(jié)果表明NEDD4-1能介導(dǎo)TrkA的泛素化，并將其帶到蛋白酶體處進(jìn)行降解。但泛素化作用如何參與并調(diào)節(jié)PC3細(xì)胞的遷移和侵襲，是下一步的主要研究方向。

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（編校：吳茜，劉路路）

Regulation effect of NEDD4-1 on ubiquitination of the TrkA in prostate cancer cells

WANG Zhi-yu1，LIXing1，GUO Xiao-jin1，XING Lian-ping2，LIU Ya1，SHAN Bao-en1Δ

（1.Department of Tumor Immunology，The Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Pathology，University of Rochester，Rochester 14624，USA）

ObjectiveTo investigate the possibility that neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1（NEDD4-1）regulates ubiquitination of the tyrosine kinase A（TrkA）in prostate cancer cells and discuss the possiblemechanism thatNEDD4-1promotes invasion andmigration of prostate cancer cells.MethodsAfter transient over-expression NEDD4-1 in PC3 cells using liposome transfection method，the interaction between exogenous NEDD4-1 and TrkA was tested by using immunoprecipitation（Co-IP）combined with immunoblotting（IB）.After co-overexpression of NEDD4-1 and ubiquitin，the ubiquitination effectof TrkA was examined using Co-IP combined with IBmethod.After co-overexpression of NEDD4-1 and ubiquitin，the ubiquitinated TrkA levelwas analyzed with or without the proteasome inhibitor MG132 treatment.ResultsAfter overexpression of NEDD4-1 in PC3 cells，the exogenous NEDD4-1 was co-precipitated with TrkA.After co-overexpression of NEDD4-1 and ubiquitin，the TrkA was ubiquitinated by exogenous NEDD4-1.The ubiquitinated TrkA level was increased after proteasome inhibitor MG132 treatment，indicating that the TrkA degradation was blocked.Conclusion TrkA protein was one of the substrate of NEDD4-1 in prostate cancer cells；NEDD4-1 regulates ubiquitination of TrkA and promots its degradation in proteasome.

prostate cancer；NEDD4-1；TrkA；ubiquitination

R285.5

A

1005－1678（2014）08－0001－04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81202037）

汪治宇，男，博士，副教授，研究方向：腫瘤免疫學(xué)，E-mail：wzyu79＠163.com；單保恩，通信作者，男，博士，教授，研究方向：免疫學(xué)，E-mail：danbaoen＠163.com。