楊建輝 呂建國(guó) 聶會(huì)勇 申曉東

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院康復(fù)中心，陜西 西安 710061)

軟骨細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎(OA)的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔1〕。細(xì)胞凋亡增加，必然導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解，基質(zhì)合成減少，且對(duì)促進(jìn)基質(zhì)合成增加的治療措施效果不佳〔2〕。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，具有抗衰老、抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性、調(diào)控細(xì)胞凋亡、雌激素調(diào)節(jié)及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性〔3，4〕。本實(shí)驗(yàn)以IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡模擬體內(nèi)炎性環(huán)境下軟骨細(xì)胞變化，研究白藜蘆醇對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡及增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 重組人白細(xì)胞介素(rhIL)-1β(Pepro-Tech)；胰蛋白酶，Ⅱ型膠原酶，DMEN/F12培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco)；Hoechst 33342，羅丹明-123(Rhodamine-123)(Sigma)；TUNEL試劑盒，SABC試劑盒(武漢博士德公司)；MTT，DMSO(Amresco)；RNA酶抑制劑(RNase，TAKaRa)；白藜蘆醇溶液由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2含藥血清和正常兔血清的制備 將白藜蘆醇按體表面積折算動(dòng)物的等效劑量〔5〕，再用生理鹽水配成8 ml溶液給新西蘭大白兔灌胃，正常兔血清則以生理鹽水8 ml灌胃。連續(xù)2次灌胃，中間間隔2 h，在末次灌胃的3 h后，乙醚和氯胺酮復(fù)合麻醉下腹主動(dòng)脈采血，4℃冰箱過(guò)夜后，離心2 500 r/min×25 min，抽取血清，56℃、30 min滅活，經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾除菌、分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取1個(gè)月齡新西蘭大耳白兔肩、膝關(guān)節(jié)軟骨，將軟骨塊用D-Hank液漂洗，剪碎至1 mm3大小，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，置振蕩器上，37℃震蕩消化1 h，然后再加入0.25%胰蛋白酶作用30 min后，將游離出的帶有酶溶液的軟骨細(xì)胞用吸管吸出，120目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，獲取軟骨細(xì)胞，細(xì)胞活力分析儀檢測(cè)細(xì)胞活力>95%。將消化所得的細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，密度105/ml(Vi-cell細(xì)胞活力分析儀計(jì)數(shù))接種于6孔板，24孔板或96孔板，置37℃，5% CO2，95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后視細(xì)胞貼壁情況更換培養(yǎng)液，以后每2天更換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞80%匯合后，培養(yǎng)基中加入不同處理因素。實(shí)驗(yàn)分為5組，A組(對(duì)照組)：培養(yǎng)液中無(wú)任何刺激因子，每孔加入正常兔血清100 μl；B組：培養(yǎng)液含10 ng/ml IL-1β+正常兔血清100 μl；C組：培養(yǎng)液含10 ng/ml IL-1β+10%含白藜蘆醇血清100 μl；D組：培養(yǎng)液含10 ng/ml IL-1β+20%含白藜蘆醇血清100 μl；E組：培養(yǎng)液含10 ng/ml IL-1β+40%含白藜蘆醇血清100 μl；每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.4.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將各組細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、核分裂象的變化。

1.4.2TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)照組和各試驗(yàn)組培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，以1×104/ml接種在放有預(yù)處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞爬片良好長(zhǎng)成單層時(shí)，移除孔內(nèi)的液體。3%過(guò)氧化氫室溫處理10 min。加0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(TBS),1∶200新鮮稀釋蛋白酶K 37℃消化15 min,每片加入20 μl TdTDIG-d-UTP標(biāo)記緩沖液的混合液(1∶1∶18)中，37℃標(biāo)記2 h。加封閉液50 μl/片，室溫30 min，甩掉封閉液，不洗，用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后50 μl/孔加之標(biāo)本片上。置樣品于濕合中，37℃反應(yīng)30 min。0.01 mol/L TBS洗2 min×3次。用抗體稀釋液1∶100稀釋SABC，混勻后加至蓋玻片上。37℃反應(yīng)30 min。0.01 mol/L TBS洗5 min×4次。DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染。0.01 mol/L TBS洗，蒸餾水洗。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果判定：切片中軟骨細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性結(jié)果。每張切片光鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)400倍視野，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.3凋亡細(xì)胞核檢測(cè) Hoechst 33342是一種能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料，在培養(yǎng)液中加入Hoechst 33342至終濃度2%，室溫下避光染色30 min后，PBS洗滌2次，置于熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)465 nm)。

1.4.4MTT比色法檢測(cè) 選經(jīng)加入處理因素培養(yǎng)24 h的96孔板細(xì)胞，每孔加入5 mg/ml MTT溶液50 μl，作用4 h，棄上清后加入150 μl DMSO，震蕩混勻15 min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A490)，計(jì)算抑制率。

1.4.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和增殖指數(shù) 選取加入處理因素培養(yǎng)24 h的6孔板細(xì)胞，胰蛋白酶消化收集各孔細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，冷PBS洗2次，70%乙醇固定，4℃過(guò)夜。上機(jī)前離心去乙醇，冷PBS洗滌后將細(xì)胞重懸于1 ml冷PBS中，RNase(10 μg/ml)37℃孵育30 min，加入碘化丙啶(PI，50 μg/ml)染色5 min后上機(jī)檢測(cè)。增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)變化 見(jiàn)圖1。正常軟骨細(xì)胞在鏡下呈片狀貼附，形態(tài)成類圓形、多邊形或多角形，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)折光顆粒，周圍有細(xì)長(zhǎng)的突起，胞核明顯呈圓形或橢圓形，核仁清晰，染色質(zhì)均勻分布，部分細(xì)胞胞體增大，可見(jiàn)核分裂象，表現(xiàn)出S期和G2/M的細(xì)胞特征。經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞呈去分化表現(xiàn)，細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，核分裂象減少。不同濃度的白藜蘆醇+IL-1β處理后的軟骨細(xì)胞，形態(tài)上與正常細(xì)胞無(wú)明顯區(qū)別。

2.2白藜蘆醇對(duì)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 A組細(xì)胞凋亡率平均僅為3.2%，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)(B組)的軟骨細(xì)胞凋亡率高達(dá)25.5%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。含10%、20%、40%白藜蘆醇血清組和IL-1β共同作用后(C組、D組、E組)的軟骨細(xì)胞凋亡率分別為19.4%，11.8%，5.3%；與B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.0361、0.0082、0.0067)；C、D、E組組間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨白藜蘆醇濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸降低，表明白藜蘆醇對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.3核形態(tài)學(xué)變化 見(jiàn)圖2。正常軟骨細(xì)胞核呈類圓形，染色質(zhì)均勻分布，經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中有許多出現(xiàn)典型的凋亡核特征，核濃縮、核碎裂，凋亡小體形成，核分裂象減少。經(jīng)不同濃度白藜蘆醇處理后的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞凋亡明顯減少。

圖1 不同處理組軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化比較(×200)

圖2 各組細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化Hoechst 33342熒光染色(×800)

2.4MTT檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。IL-1β能明現(xiàn)抑制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制率達(dá)61.3%。10%、20%、40%白藜蘆醇組對(duì)IL-1β作用的軟骨細(xì)胞均有保護(hù)作用，其抑制率分別為33.2%、24.3%、13.4%，呈劑量依賴性。

表1 不同處理組細(xì)胞周期分布及增殖指數(shù)±s，%)

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。正常軟骨細(xì)胞增殖能力旺盛，細(xì)胞PI達(dá)到23.4%；IL-1β處理的軟骨細(xì)胞PI明顯低于正常細(xì)胞，僅為7.3%，具有分裂象的S期和G2/M期細(xì)胞明顯減少；而加入白藜蘆醇組S期和G2/M期細(xì)胞明顯增多，PI明顯高于IL-1β誘導(dǎo)組，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，呈劑量依賴趨勢(shì)。

3 討 論

研究證實(shí)了軟骨細(xì)胞凋亡在OA發(fā)病中的主要作用，也為抑制軟骨細(xì)胞凋亡作為治療手段提供了依據(jù)〔6〕。由于關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)不含血管和軟骨細(xì)胞被軟骨基質(zhì)所包繞，機(jī)體內(nèi)的巨噬細(xì)胞無(wú)法清除已經(jīng)發(fā)生凋亡的軟骨細(xì)胞，存留的凋亡小體通過(guò)釋放基質(zhì)金屬蛋白酶等酶類加速軟骨組織的降解〔1〕。

研究表明前炎性介質(zhì)IL-1β、NO在OA發(fā)病中起著重要的作用，可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡〔7〕。IL-1β是存在于骨關(guān)節(jié)炎軟骨及滑液中的重要炎性因子，不僅抑制軟骨基質(zhì)的合成，加速膠原和蛋白多糖的降解，而且抑制軟骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞和炎癥反應(yīng)〔8，9〕，已作為人工制作OA模型的誘導(dǎo)劑而廣泛使用〔10〕。

白藜蘆醇是植物為抵抗外界刺激如紫外線、真菌、病毒感染或機(jī)械損傷而產(chǎn)生的一種植物抗毒素，存在于多種植物中。體外實(shí)驗(yàn)中白藜蘆醇可抑制白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的軟骨基質(zhì)的降解〔11〕，并可抑制IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞caspase-3(細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者)的激活，故認(rèn)為白藜蘆醇可在體外抑制軟骨細(xì)胞的凋亡〔12〕。在脂多糖誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎中，予關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射白藜蘆醇，可明顯減少軟骨基質(zhì)蛋白多糖的丟失及軟骨的破壞〔13〕。NO是OA發(fā)病機(jī)制中的重要介質(zhì)，可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，在OA模型狗的實(shí)驗(yàn)中，抑制NO，可以降低軟骨細(xì)胞的凋亡率，減輕軟骨的破壞〔14，15〕。予OA模型兔口服白藜蘆醇，關(guān)節(jié)滑液中NO的水平明顯降低〔16〕。本實(shí)驗(yàn)顯示白藜蘆醇能明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

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