張國強 李 玲 程 毅 高順強

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050011)

毛乳頭細胞是位于毛囊基底部的一群真皮源性細胞，其顯著的生物學特性為體內(nèi)外表現(xiàn)為凝集性的生長方式及體內(nèi)外具有誘導毛囊形成的能力。研究表明毛乳頭細胞分泌的多種生長因子如胰島素樣生長因子1(IGF-1)，成纖維細胞生長因子7 (FGF7)及干細胞因子(SCF)等均可以促進體外培養(yǎng)的人毛乳頭細胞的增殖〔1，2〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)即血管滲透因子或血管調(diào)理素。它是毛乳頭自分泌的一種生長因子并可作用于毛乳頭細胞。VEGF的生物學功能一是增加血管的通透性，二是刺激血管生成〔3，4〕。本實驗旨在觀察不同代次毛乳頭細胞表達VEGF的情況，并通過人工干預的方法加入VEGF觀察其對毛乳頭細胞生長曲線的影響。

1 材料和方法

1.1設計 細胞對比觀察實驗。時間及地點：實驗于2009年5月至2010年12月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心及河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院耳鼻喉科實驗室完成。

1.2材料 頭皮取自2009～2010年河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院神經(jīng)外科手術患者，年齡20～40歲，無系統(tǒng)性疾病，均取得患者同意，離體6 h進行實驗。

1.3試劑 分離酶、膠原酶D、L-谷氨酰胺、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜購于美國Sigma公司，鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體購于美國Neomarker公司，胎牛血清購于杭州四季青生物材料有限公司，重組人VEGF、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，VEGF單克隆抗體購于北京中杉金橋生物有限公司。

1.4毛乳頭細胞的分離培養(yǎng) 人毛乳頭細胞采用兩步酶消化分離法分離〔5〕，得到純化的人毛乳頭細胞加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻后，以每培養(yǎng)瓶30～50個毛乳頭的密度接種。待毛乳頭貼壁后換液，去除未貼壁的單個細胞及雜質(zhì)。分離出的毛乳頭3 d后90%貼壁，貼壁1 d后可觀察到細胞遷出呈放射狀生長，通過α-平滑肌肌動蛋白染色、甲苯胺藍染色、PAS染色鑒定為毛乳頭細胞。2～3 w后細胞大部分生長融合。6代之前細胞可見凝集性生長，隨細胞傳代次數(shù)增加該特性逐漸消失。免疫組織化學染色檢測血管內(nèi)皮生長因子表達：分別取凝集性生長的第3代、第6代和非凝集性生長的第9代毛乳頭細胞，0.25%胰酶消化后接種至放有蓋玻片的6孔板中，體積分數(shù)5%CO2溫箱37℃孵育24 h，收取蓋玻片，40 g/L多聚甲醛固定15 min，4 ℃過夜。以鼠抗人VEGF單克隆抗體作一抗對3個代次的毛乳頭細胞進行染色，按SP法介紹的步驟進行〔6〕。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.5流式細胞儀檢測VEGF表達 取第3，6，9代毛乳頭細胞，洗滌后調(diào)整毛乳頭細胞濃度為1×109/L，分別加入兔抗人VEGF單克隆抗體工作液，室溫避光反應2 h，PBS液洗滌后，加入二抗工作液100 μl，孵育30 min，PBS洗滌，上流式細胞儀檢測。結果分析：生長因子表達量用均道值表示。

1.6MTT法檢測血管內(nèi)皮生長因子對毛乳頭細胞生長的影響 取對數(shù)生長期的第3代人毛乳頭細胞，調(diào)整細胞濃度為1×107/L，按每孔200 μl加入96孔板中，將實驗分為20 μg/L的VEGF組及只加培養(yǎng)基的空白對照組。每組設7個時相點，每個時相點設3個復孔。隔日檢測1次。于各時相點時前4 h，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清液，棄之，過每管加入二甲基亞砜150 μg，避光條件下振蕩10～15 min，用全自動酶標儀于波長492 nm處測定各孔吸光度值，所有實驗重復3次，記錄結果。

1.7主要觀察指標 免疫組織化學法和流式細胞儀測定第3，6，9代人毛乳頭細胞中VEGF的表達。MTT法測定VEGF對人毛乳頭細胞的增殖作用。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1毛乳頭細胞中VEGF的表達 VEGF表達于細胞胞質(zhì)，著色由黃色到褐色不等。胞質(zhì)出現(xiàn)黃色顆粒為(+)，棕色顆粒為()，褐色顆粒為()。第3，6，9代毛乳頭細胞免疫組織化學染色后VEGF表達分別為、和+。VEGF隨著毛乳頭細胞代次的增多，表達逐漸減弱，空白對照為陰性。見圖1。

2.2流式細胞儀檢測結果 第3，6，9代毛乳頭細胞VEGF的均道值分別為312.94±7.98，269.62±31.42，180.16±15.40，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩兩相比差異顯著(F=21.42,P=0.002)。

第3代

第6代

第9代

2.3MTT法檢測VEGF對毛乳頭細胞生長的影響 根據(jù)MTT測得的A值，可見兩組細胞的停滯期不盡相同，3代細胞的VEGF組為2 d，而空白對照組為4 d，隨后進入對數(shù)生長期。并且VEGF組在10 d后與已經(jīng)進入緩慢生長期的空白對照組相比仍然保持著良好的生長狀態(tài)。通過比較各組細胞的吸光度(A)值發(fā)現(xiàn)3代細胞體外培養(yǎng)4 d后VEGF組較空白對照組明顯升高。隨著培養(yǎng)時間的延長，VEGF組的A值與空白對照組相比明顯升高，A值在一定范圍內(nèi)可以反映細胞數(shù)，故VEGF可以促進毛乳頭細胞的增殖。見表1。

表1 血管內(nèi)皮生長因子對毛乳頭細胞的吸光度值的影響±s)

3 討 論

VEGF和毛囊生物學有著密切的關系，很多學者在這方面進行了研究。Lachgar等〔7〕通過免疫組織化學的方法發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的大鼠觸須毛囊的毛乳頭細胞在生長期抗VEGF染色陽性，體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞胞質(zhì)中抗VEGF染色亦陽性。進一步研究證明了VEGF能特異性地結合培養(yǎng)的鼠觸須毛乳頭細胞，并促進其增殖和遷移，其促進毛乳頭細胞增殖的最大效應為堿性成纖維細胞生長因子的一半，而對遷移的影響為堿性成纖維細胞生長因子的3倍，應用抗VEGF的中和性抗體可以阻斷重組VEGF和毛乳頭起源的VEGF的活性，從而首次證實VEGF是毛乳頭細胞的一種自分泌生長因子。Kozlowska等〔8〕采用RT-PCR和Northern印跡法證明培養(yǎng)的毛乳頭細胞可以分泌VEGF121、VEGF145、VEGF165和VEGF189，4種形式的VEGF mRNA，其中以VEGF121含量最高，而VEGF189含量最低，進一步利用放射免疫沉淀法證明毛乳頭細胞提取物和培養(yǎng)的上清中有VEGF蛋白的表達，還通過免疫組織化學證明毛乳頭細胞胞漿抗VEGF染色亦陽性。臨床上促進毛發(fā)生長的藥物如：米諾地爾，拉坦前列素及各種中藥都促進毛乳頭細胞合成和分泌VEGF，并且分泌VEGF的量和藥物濃度有劑量依賴關系〔9～11〕。反之斑禿患者的毛乳頭細胞VEGF表達減弱或消失。而雄激素性脫發(fā)患者脫發(fā)區(qū)與非脫發(fā)區(qū)毛乳頭的體外培養(yǎng)結果顯示，脫發(fā)區(qū)毛乳頭體積較小，毛乳頭細胞生長緩慢，毛乳頭細胞分泌VEGF的量減少，而細胞形態(tài)和凝集性生長無明顯變化〔11〕?？梢娒轭^細胞分泌VEGF障礙與毛發(fā)疾病有相關性。

郭曉靜等〔12〕也證明體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞能夠合成與分泌VEGF，VEGF表達胞質(zhì)內(nèi)，并隨著體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞傳代次數(shù)的增多，VEGF的表達逐漸減弱。本實驗結果顯示，隨著體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞傳代次數(shù)的增加VEGF表達減弱，VEGF可以縮短毛乳頭細胞生長曲線的停滯期，提早進入對數(shù)生長期，并且延遲進入平臺期的時間。VEGF是毛乳頭細胞的自分泌因子，當毛乳頭細胞的合成分泌功能降低時，其生長增殖功能以降低。VEGF對細胞增殖有明顯促進作用，但其具體作用機制還有待繼續(xù)研究。

4 參考文獻

1張國強， 李 玲， 程 毅，等.干細胞因子對體外培養(yǎng)毛乳頭細胞生長特性的影響〔J〕.中國皮膚性病學雜志，2010；24(11): 1000-2.

2張國強，程 毅，李 玲，等.胰島素樣生長因子-1和成纖維細胞生長因子7與毛乳頭細胞的生長〔J〕.中國組織工程與臨床康復雜志，2010；14(50): 9346-8.

3Kajdaniuk D,Marek B,Foltyn W,etal.Vascular endothelial growth factor (VEGF) -part 1: in physiology and pathophysiology〔J〕.Endokrynol Pol,2011；62(5): 444-55.

4羅美蓉，王正偉，安志星.人血管內(nèi)皮生長因子研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(17): 3835-7.

5程 波，劉榮卿，伍津津，等.改良毛乳頭細胞培養(yǎng)法〔J〕.中華皮膚科雜志，2001；34(5): 387-8.

6Randall VA,Hibbrts NA,Hamada K,etal.A comparison of the cultured and growth of dermal papilla cells derived from normal and balding〔J〕.Br J Dermatol,1996;134(3): 437-44.

7Lachgar S,Moukadiri H,Jonca F,etal.Vascular endothelial growth factor is an autocrine growth factor for hair dermal papilla cells〔J〕.J Invest Dermatol,1996;106(1):17-23.

8Kozlowska U,Blume-Peytavi U,Kodelja V,etal.Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in various compartments of the human hair follicle〔J〕.Arch Dermatol Res,1998;290(12): 661-8.

9Han JH,Kwon OS,Chung JH,etal.Effect of minoxidil on proliferation and apoptosis in dermal papilla cells of human hair follicle〔J〕.J Dermatol Sci,2004;34(2): 91- 8.

10關寧寧，陳蕾，孫蔚凌，等.精氨酸對人毛乳頭細胞增殖的影響〔J〕.臨床皮膚科雜志，2011；40(6)：335-9.

11陳 蕾，關寧寧，孫蔚凌，等.咖啡因?qū)w外培養(yǎng)人毛囊及毛乳頭細胞的影響〔J〕.臨床皮膚科雜志，2011；40(6)：323-7.

12郭曉靜，郝 飛，姜曉勇，等.人毛乳頭細胞在不同傳代時期某些細胞因子表達的變化〔J〕.第三軍醫(yī)大學學報，2006；28(21)：2144-5.