徐 敏 鮑 芳 喬魯軍

(東營(yíng)市勝利油田中心醫(yī)院，山東 東營(yíng) 257000)

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)收治的膿毒癥患者亦趨于老齡化，老年患者常并發(fā)各種器官功能不全，更易發(fā)展為膿毒癥休克、多器官障礙綜合征(MODS)〔1～3〕。因此治療藥物的選擇上更加慎重，烏司他丁作為改善炎癥反應(yīng)的藥物，近年來(lái)在使用安全上有較好的優(yōu)勢(shì)，但其療效及使用劑量上仍有不同的意見(jiàn)〔4～6〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS干預(yù)EPCs后加入不同劑量的烏司他丁以檢測(cè)EPCs增殖、遷移功能，來(lái)模擬LPS誘導(dǎo)膿毒癥后，烏司他丁對(duì)EPCs的作用，以期在細(xì)胞水平觀察烏司他丁對(duì)膿毒癥的影響。

1 材料與方法

1.1EPCs來(lái)源 采集健康志愿者外周靜脈血，采用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，鋪板并培養(yǎng)，PBS除去非貼壁細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)至7 d。

1.2EPCs鑒定 將貼壁細(xì)胞與DiI-acLDL(2.4 μg/ml) (Biomedical公司，美國(guó))在 37℃下共孵育1 h后檢測(cè) DiI-acLDL的攝取量。2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min后PBS漂洗。37℃下與FITC-UEA-I (10 μg/ml) (Vector 公司，美國(guó)) 孵育1 h。最后采用激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope， LSCM，Zeiss公司，德國(guó))觀察，若細(xì)胞呈現(xiàn)Dil-acLDL和UEA-I雙染色陽(yáng)性，說(shuō)明EPCs鑒定成功。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 貼壁細(xì)胞隨機(jī)分成4組：①空白對(duì)照組：EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)EPCs 48 h。②LPS組：采用EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液配置的LPS液(100 ng/ml)培養(yǎng)EPCs 48 h。③烏司他丁-1、-2、-3組：采用EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液配置的LPS液(100 ng/ml)培養(yǎng)EPCs 24 h后，再用前述LPS液配置的三種不同濃度烏司他丁液(100、200、400 IU/ml)培養(yǎng)EPCs 24 h。因細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分的需求，每24小時(shí)換液1次。

1.4增殖功能檢測(cè) EPCs經(jīng)過(guò)3 d的傳代培養(yǎng)，用PBS洗除非貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化并離心(1 500 r/min)。除去上液，將細(xì)胞懸浮于EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105/ml。接種EPCs到96孔板，每孔加100 μl細(xì)胞懸浮液。24 h后去除上清液，加入EGM-2MV使細(xì)胞同步化，光學(xué)相差顯微鏡觀察每孔內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)均勻。各孔加入10 μl MTT液，4 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處OD值。

1.5細(xì)胞遷移 EPCs經(jīng)過(guò)3 d的傳代培養(yǎng)，用PBS洗除非貼壁細(xì)胞，再用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心(1 500 r/min)4 min，棄上液，懸浮于EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106/ml。向第1組Transwell下室加入600 μl EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液、第2～5組加入配置好的LPS液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并將100 μl EPCs 懸液接種到上室，上室與下室之間隔以 8.0 μm 孔徑硝酸纖維膜。37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)試劑，再孵育24 h，向下室加入60 μl MTT 液，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的OD值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，組間比較根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)與否，采用S-N-K法或Tamhane方法。

2 結(jié) 果

2.1EPCs鑒定 光學(xué)相差顯微鏡下觀察EPCs細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞成簇排列，成短梭狀，增殖良好(見(jiàn)圖1)。用FITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色后采用LSCM觀察熒光表達(dá)：FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs，雙染陽(yáng)性細(xì)胞的百分率均在94%左右。

圖1 光學(xué)相差顯微鏡觀察下的EPCs

2.2細(xì)胞增殖 EPCs與LPS共孵育之后細(xì)胞增殖能力顯著降低(P=0.000)。烏司他丁加入后EPCs的增殖OD值均有提高，且隨烏司他丁濃度增加，其增殖能力亦由顯著提高，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3對(duì)遷移的影響 與空白對(duì)照組比較，EPCs遷移OD值在LPS作用后明顯降低(P=0.001)，與烏司他丁作用后，EPCs遷移能力較LPS組有改善，并見(jiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 LPS和不同濃度烏司他丁作用下EPCs的增殖、遷移OD值±s，n=10)

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥、免疫、凝血等一系列基本問(wèn)題，可以導(dǎo)致膿毒癥休克和多器官障礙綜合征，是目前全球所有重癥醫(yī)學(xué)科病人死亡的主要原因〔7，8〕。各種感染一旦誘發(fā)全身反應(yīng)綜合征(SIRS)，均稱(chēng)為膿毒癥，隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)以及醫(yī)保覆蓋人群的增加，ICU病房?jī)?nèi)，老年患者的床位占有率有逐年升高趨勢(shì)，老年患者往往存在臟器功能基礎(chǔ)差、多重耐藥菌定植、易合并院感等特點(diǎn)，膿毒癥極易向重癥膿毒癥、感染性休克轉(zhuǎn)化，“后抗生素時(shí)代”往往在這些患者身上得到更好地詮釋。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,在生理或病理因素刺激下,可從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血管的修復(fù)〔9〕。EPCs對(duì)膿毒癥血管損傷的修復(fù)發(fā)揮重要作用，研究表明，膿毒癥時(shí)，EPCs被動(dòng)員、遷移、黏附在損傷血管處，不斷分化為內(nèi)皮細(xì)胞(EC)，修復(fù)損傷血管，改善微循環(huán)〔10～12〕。

烏司他丁是健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)的一種酸性糖蛋白，具有抑制廣譜蛋白酶的作用，分子量67 kD，由143個(gè)氨基酸殘基組成〔13〕。目前研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體在休克和炎癥的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基以及炎性介質(zhì)，造成組織細(xì)胞損害，烏司他丁能夠抑制氧自由基的產(chǎn)生、抑制多種炎性介質(zhì)及心肌抑制因子，改善微循環(huán)，起到抗炎、抗休克作用，避免疾病惡化〔14～16〕。進(jìn)一步從分子水平研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可以上調(diào)IL-10 水平，抑制 NF-κB活性〔17〕，抑制炎癥反應(yīng)，改善細(xì)胞損傷，烏司他丁對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道〔18〕，但對(duì)EPCs的作用鮮有研究。

4 參考文獻(xiàn)

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