時英英 楊 靖 時學(xué)秀 單 杰

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 鄭州 450052)

轉(zhuǎn)錄因子BTB-CNC同源異構(gòu)體(Bach)1屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族，在體內(nèi)廣泛存在，它是一種堿性亮氨酸拉鏈蛋白，其包含一個堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和一個鋅指結(jié)構(gòu)域，二者皆與Bach1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用有關(guān)〔1〕。關(guān)于Bach1的研究主要集中在其對血紅素氧化酶1(HO-1)的作用上。HO-1具有抗氧化、抗凋亡等效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)HO-1是一類保護(hù)細(xì)胞及抗氧化損傷的酶類，其表達(dá)可通過許多轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控。Bach1在核內(nèi)抑制HO-1的表達(dá)〔2〕。

1 材料與方法

1.1材料 大腸桿菌菌株E.Coli.DH5α、質(zhì)粒pBI-EGFP、質(zhì)粒pTet-Off、人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721：本室保存；質(zhì)粒pQE30-Bach1：美國教授饋贈；限制性核酸內(nèi)切酶NheⅠ，MluⅠ，KpnⅠ，HindⅢ：Fermentas公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒：上海捷瑞生物工程股份有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基：Gibco公司； 無支原體胎牛血清：北京索來寶公司；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑：Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒：華北制藥集團(tuán)有限公司。

1.2重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1的構(gòu)建

1.2.1目的基因Bach1的獲取 采用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)菌，質(zhì)粒pQE30-Bach1轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α，使用質(zhì)粒提取試劑盒小量提取質(zhì)粒,從提取的質(zhì)粒 DNA中吸出少量,適當(dāng)稀釋,使用紫外分光光度儀測定 OD260,計(jì)算質(zhì)粒濃度，雙酶切鑒定質(zhì)粒pQE30-Bach1，PCR擴(kuò)增Bach1片段，PCR產(chǎn)物純化回收，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用凝膠成像系統(tǒng)分析酶切結(jié)果。

1.2.2構(gòu)建重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1雙酶切 處理質(zhì)粒載體pBI-EGFP及目的基因Bach1，1%瓊脂糖凝膠電泳后,使用膠回收試劑盒按說明書分別回收pBI-EGFP和Bach1，純化后片段在 T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，提取并鑒定重組質(zhì)粒。

1.3重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的表達(dá)

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)肝癌細(xì)SMMC-7721，隔天換液,保持細(xì)胞生長狀態(tài)良好，每次實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.3.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞 細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×105/孔接種在96孔板中，分為三組 ①陰性對照即未轉(zhuǎn)染組；②空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組pBI-EGFP和Tet-off；③重組質(zhì)粒組pBI-EGFP-Bach1和Tet-off的細(xì)胞。每組設(shè)3個平行孔。24 h貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染參考說明書并按照需要改動。

1.3.3RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)錄因子Bach1、HO-1的RNA表達(dá) RT2-PCR鑒定重組質(zhì)粒mRNA表達(dá)提取細(xì)胞總RNA,使用InvitrogenM2MVLcDNA第一鏈合成試劑盒合成 cDNA第一鏈,取上述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物各 2 μg作為 PCR擴(kuò)增的模板。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,用RGB顏色分析器4.0分析電泳結(jié)果，用掃描所得出Bach1、HO-1基因與β-actin基因的灰度值比值表示該基因的相對表達(dá)水平，并對Bach1、HO-1基因在空白組，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.4重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1對肝癌細(xì)胞SMMC-7721藥物敏感性的影響 MTT〔3〕法檢測細(xì)胞對長春新堿(VCR)的藥敏性，設(shè)立對照組，未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組。其中對照組細(xì)胞不做藥物或轉(zhuǎn)染處理，未轉(zhuǎn)染組只用長春新堿處理，轉(zhuǎn)染組先轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后，加入不同濃度的VCR溶液：0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 μg /ml，MTT法檢測三組肝癌細(xì)胞對VCR的藥敏性。計(jì)算存活率〔存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值)×100%〕。計(jì)算50%細(xì)胞生長抑制所需的VCR藥物濃度即半數(shù)抑制率(IC50)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1雙酶切鑒定質(zhì)粒pQE30-Bach1 KpnⅠ/HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pQE30-bach1后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到約3 400 bp和約2 200 bp的片段，大小與質(zhì)粒pQE30及目的基因Bach1一致(見圖1)。說明質(zhì)粒pQE30-Bach1中含有目的基因Bach1基因全序列。

2.2PCR擴(kuò)增Bach1片段的純化回收 PCR擴(kuò)增出含有酶切位點(diǎn)MluI/NheI的目的基因Bach1片段后回收，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到約2 200 bp片段，大小與目的基因Bach1一致。(見圖2)。

2.3重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1的鑒定 MluⅠ/NheⅠ雙酶切處理連接后得到的質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見約5 100 bp和約2 200 bp的片段，大小與質(zhì)粒pBI-EGFP及目的基因Bach1一致(見圖3)。用目的基因Bach1的引物PCR鑒定重組質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見約2 200 bp大小的片段(見圖3)。重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1構(gòu)建成功。

1：HindⅢ單酶切質(zhì)粒pQE30-Bach1結(jié)果；2：KpnⅠ/HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pQE30-bach1結(jié)果

1，2，3皆為用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因Bach1所得條帶

1：MluⅠ/NheⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1所得條帶；2：使用重組質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增目的基因Bach1所得條帶

2.4RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的表達(dá) 重組質(zhì)粒組的Bach1特異片段明顯比對照組，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組亮。β-actin灰度值的比值依次為：1.04±0.32，1.02±0.39，1.77±0.35差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與1，2組相比3組HO-1明顯較暗，β-actin灰度值的比值依次為：0.95±0.22，1.02±0.31，0.74±0.21，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明HO-1基因在轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)明顯比未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞低。結(jié)果說明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1后，肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Bach1表達(dá)顯著增高，同時抑制了HO-1的表達(dá)，使其表達(dá)水平降低。見圖4。

1：空白對照組；2：空轉(zhuǎn)載體組；3重組質(zhì)粒組

2.5不同組別藥物濃度對SMMC-7721細(xì)胞的抑制率 轉(zhuǎn)染組重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1的細(xì)胞，在加入VCR后凋亡率比同等劑量未加入重組質(zhì)粒的細(xì)胞明顯升高。轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組之間差異明顯(P<0.05)。未轉(zhuǎn)染組的IC50為0.21 μg/ml，轉(zhuǎn)染組的IC50為0.15 μg/ml。二者相比，轉(zhuǎn)染組的半數(shù)抑制濃度低于未轉(zhuǎn)染組28.6%。見表1。

表1 不同組別藥物濃度對SMMC-7721細(xì)胞的抑制率(%)

3 討 論

本研究通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1。再將重組質(zhì)粒和其調(diào)控質(zhì)粒Tet-off一同轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721中，通過RT-PCR技術(shù)在RNA水平上可明顯看到重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1能顯著抑制細(xì)胞中HO-1的表達(dá)，基于使用HO-1抑制劑在腫瘤內(nèi)抑制HO-1活性〔3〕，以達(dá)到增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的對藥物的敏感性，使其在低濃度藥物作用下即能凋亡這一思路，本實(shí)驗(yàn)將重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1及其調(diào)控質(zhì)粒Tet-off，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721中，使用長春新堿進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的體外藥敏試驗(yàn)。有研究表明長春新堿對培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721有較顯著的抗癌作用〔4〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相同劑量藥物作用下，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1的細(xì)胞，在加入VCR后凋亡率比同等劑量未加入重組質(zhì)粒的細(xì)胞明顯升高。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了可通過抑制HO-1的表達(dá)來增加肝癌細(xì)胞對藥物的敏感性，減輕對正常細(xì)胞的傷害。

4 參考文獻(xiàn)

1郁衛(wèi)東，梁 蓉，楊麗君，等.人類21號染色體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因作為早期分子診斷標(biāo)記物的可行性研究〔J〕.中國生物工程雜志，2005；25(7)：66-70.

2Tomomi K,Kazuhiro T,Kazuhiro O,etal.Bach1 functions as a hypoxia-inducible repressor for the Heme Oxygenase-1 gene in human cells〔J〕. J Biol Chem，2003；278(11):9125-33.

3尤迎春，叢文銘，王 一，等.MTT比色分析法快速測定肝癌細(xì)胞株對化療藥物敏感性的方法研究〔J〕.癌癥，1996；15(3)：219-21.

4馬瑾瑜，余竹元，竺葉青，等.長春新堿對培養(yǎng)中的人肝癌細(xì)胞的作用〔J〕.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1987；14(3)：2.