孫雅彬 王大廣 宋 鄂 葉 飛 張 泳 孫雅敏 徐越超

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科，吉林 長春 130021)

Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在生理和病理情況下均起到重要的作用。解剖發(fā)現(xiàn)，Müller細(xì)胞、神經(jīng)元以及血管之間存在一種特殊的密切的生理關(guān)系，通過Müller細(xì)胞可以快速檢測視網(wǎng)膜的自我平衡并做出回應(yīng)〔1，2〕。視網(wǎng)膜是體內(nèi)耗能最高的組織，Müller細(xì)胞通過新陳代謝為視網(wǎng)膜為提供代謝能量〔3〕。Müller細(xì)胞直接向高耗能的光感受器〔4〕運(yùn)送營養(yǎng)，包括葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸以及氨基酸〔5,6〕。與光感受器完全相反，Müller細(xì)胞對低氧、缺氧癥以及低血糖癥具有很強(qiáng)的耐受能力〔7〕。 Müller細(xì)胞通過糖原沉積，延長了其在有害環(huán)境下的生存期〔8〕。基于Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的重要作用，本研究通過體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞內(nèi)信號傳統(tǒng)通路的研究，為各種視網(wǎng)膜疾病的機(jī)制研究提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1Müller 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)我們的既往研究體外培養(yǎng)及鑒定大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞〔9〕。于倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)液有無污染，觀察從大鼠視網(wǎng)膜分離出的Müller細(xì)胞貼壁情況，以及細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化、生長特性等。

1.2蛋白通路分析 Müller 細(xì)胞(1×106) 于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)無血清DMEM培養(yǎng)24 h。用1倍細(xì)胞裂解液(Cell Signaling Technology公司，美國Danvers)包含20 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L焦磷酸鈉，1 mmol/L β-甘油磷酸鈉，1 mmol/L Na3VO4，1 μg/ml亮抑蛋白酶肽，提取細(xì)胞總蛋白。 每個(gè)培養(yǎng)皿中加入300 μL裂解液，用細(xì)胞刮板刮除培養(yǎng)皿表面的單層細(xì)胞。細(xì)胞裂解產(chǎn)物超聲裂解15 s，2次，14 000 r/min，4℃，離心30 min。BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce公司，美國Rockford)檢測蛋白質(zhì)濃度。每孔加入300 μg蛋白質(zhì)，10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)至尼龍膜上。將尼龍膜以5%的牛奶或3%牛血清蛋白在室溫下封閉1 h。將尼龍膜固定在免疫印跡雜交盒內(nèi)，雜交盒有20條雜交道，每條雜交道可加2～3種一抗，抗體結(jié)合到蛋白質(zhì)上，4°C孵育過夜。 清晰印記后，與二抗在室溫下雜交1 h。清洗尼龍膜后加入化學(xué)發(fā)光液。用凝膠成像系統(tǒng)拍攝化學(xué)發(fā)光信號。用光密度掃描系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)含量，并且使用內(nèi)參制定測定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析 應(yīng)用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，進(jìn)行蛋白質(zhì)之間生物功能的關(guān)聯(lián)性分析。 將PPA中檢測到的表達(dá)的蛋白質(zhì)輸入IPA軟件，進(jìn)行經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路的功能性分析〔10〕。以IPA軟件內(nèi)已知文獻(xiàn)中各基因或蛋白質(zhì)的相互作用為基礎(chǔ)，將輸入蛋白質(zhì)之間的直接或間接的作用進(jìn)行分析，并最終構(gòu)建出新的信號通路。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 所有的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)均在不同時(shí)間重復(fù)3次。PPA重復(fù)2次。應(yīng)用IPA軟件進(jìn)行信號通路分析。

2 結(jié) 果

2.1體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞的形態(tài) 自大鼠視網(wǎng)膜分離出的原代組織塊為無色半透明，Müller細(xì)胞呈無色透明小圓點(diǎn)狀，漂浮于培養(yǎng)液中(圖1A)；約24～48 h大部分細(xì)胞貼壁生長，呈短梭形，無色透明，組織塊周圍可見短梭形細(xì)胞伸出(圖1B)；3～5 d，細(xì)胞體態(tài)逐漸變長，兩端出現(xiàn)分支，無色透明(圖1C)，7～10 d，細(xì)胞密集生長呈長梭形，平行有序排列，無色透明(圖1D)，可以傳代供實(shí)驗(yàn)使用。

A：原代培養(yǎng)；B：24～48 h；C：3～5 d；D：7～10 d

2.2視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中的信號傳統(tǒng)網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用146種磷酸化及磷酸化蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有108種磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)在體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller中表達(dá)：磷酸化蛋白：p-PKCα, p-PDK1, p-PKC α/βII, p-p53, p-Akt, p-PTEN, p-RB, p-β-catenin, p-c-Jun, p-Stat3, p-ERK, p-GSK-3α/β, p-p70 S6 kinase, p-eIF4B, p-HGFR, p-Smad, p-ERK5 , p-p90RSK, p-CREB, p-PKCδ, p-FAK, p-cdc2, p-Stat5, p-p38；非磷酸化蛋白：FAS, FOXM1, Syk, MetRS, Twist, Lyn, KLF6, CaMKKα, SK3, Stat1, cyclin B1, cyclin D1, Cdk6, Cdc25B, cyclin E, Cdk2, p27, TDP1, Cdk4, HER2, 14-3-3β, cPKCα, ERK, EGFR, SLUG, Cdc25C, Hsp90, CHK1, MDM2, Cdc2 p34, E2F-1, PCNA, p63, p38, Rap 1, β-catenin, Akt, HCAM, XIAP, Bcl-2, patched, HIF-1α, HIF-2α, TTF-1, p53, Notch4, PTEN, SRC-1, Eg5, HIF-3α, Bax, N-cadherin, TNF-α, Cdc42, eIF4B, vimentin, OPN, survivin, E-cadherin, TGF-β, ERβ, WT1, mesothelin, VEGF, ATF-1, Ep-CAM, Bad, NFκB52, NFκB p50, calretinin, IL-1β, H-Ras, Bcl-6, K-Ras, α-tubulin, NFκB p65, CREB, BID, maspin, DRG1, factor XIII B, IGFBP5, HCAM, ICAM-1, ERα, c-Flip, PSM, Rab 7, VCAM-1, FGF-8, NEP, Bcl-xL, endoglin, Bak, TFIIH p89, Nkx-3.1, RIP, NM23, c-IAP2, Epo, uPA, PDEF, Stat 3, ERCC1, uPAR, KAI1, L-selectin, PSCA, E-selectin。

基于IPA結(jié)果，這些蛋白質(zhì)參與了幾條重要的信號傳導(dǎo)通路，包括XIAP/Apoptosis信號通路(p-p53, NFκB p65, p38, Bax, NFκB p50, c-IAP2, TNF-α, Bak, XIAP)，PI3K/AKT 信號通路(p-p53, NFκB p65, p-Akt, p38, 14-3-3 β, Hsp90, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, PTEN)，ILK信號通路(VEGF, NFκB p65, p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, HIF-1α, NFκB p50, Cyclin D1, TNF-α, PTEN)，PTEN信號通路(NFκB p65, p-Akt, p-p38, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, Bcl-xL, PTEN)，細(xì)胞周期：G1/S 節(jié)點(diǎn)調(diào)控信號通路(p-p53, p-RB, Cyclin E, Cdk4, Cdk6, Cyclin D1, Cdc2 p34)，HIF-1α信號通路(VEGF, Epo, p-p53, p-Akt, p38, Hsp90, HIF-1α)，細(xì)胞周期：G2/M 節(jié)點(diǎn)調(diào)控信號通路(Cdc25B, p-p53, Cdc25C and Cyclin B1, 14-3-3 β)，HGF信號通路(p-Akt, p-p38, p-Stat3, Cyclin D1, Cdc2 p34)，糖尿病信號通路(NFκB p65, p-Akt, p38, NFκB p50, TNF-α)，NFκB 信號通路(NFκB p65, p-Akt, RIP, IL-1β, NFκB p50, TNF-α)，VEGF 信號通路(VEGF, p-Akt, p38, HIF-1α)，ERK/MAPK信號通路(p38, p-GSK-3α/β, p-Stat3)和胰島素受體信號通路(p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, PTEN)。提示Müller 細(xì)胞中信號傳導(dǎo)通路共同決定Müller細(xì)胞的生物學(xué)特性。

3 討 論

Müller細(xì)胞通過上調(diào)營養(yǎng)因子以及抗氧化物為視網(wǎng)膜提供直接和間接營養(yǎng)支持。主要的細(xì)胞因子和生長因子包括腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性纖維母細(xì)胞生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素生長因子1、神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3以及色素上皮衍生因子〔11～14〕。這些因子可能單獨(dú)或共同起作用并通過直接或間接機(jī)制保護(hù)應(yīng)激的神經(jīng)元。例如，Müller細(xì)胞可能會直接釋放堿性纖維母細(xì)胞生長因子以支持應(yīng)激的神經(jīng)元〔15〕，或者M(jìn)üller細(xì)胞可能會通過激活應(yīng)激誘發(fā)白血病抑制因子或通過注射α2腎上腺素能激動劑上調(diào)堿性纖維母細(xì)胞生長因子〔13,16〕。Müller細(xì)胞也會通過上調(diào)抗氧化物保護(hù)光感受器免受氧化損傷，如谷胱甘肽、鐵氧化酶、血漿銅藍(lán)蛋白以及血紅素氧化酶〔14〕。

Müller細(xì)胞會傳遞能夠吸收和循環(huán)神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶。谷氨酸是一種基本的視網(wǎng)膜神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，而且必須對它進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)管以保護(hù)視網(wǎng)膜免受興奮性損傷或者是為高分辨率(高的信噪比)視覺信號而對其進(jìn)行監(jiān)管〔17,18〕。

通過Müller細(xì)胞傳遞的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 (EAAT)1～5，尤其是EAAT 1/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，迅速地將過量的谷氨酸移出細(xì)胞外隙〔2,19〕。然后，通過谷胺酰胺合成酶將谷氨酸轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺，谷胺酰胺合成酶是一種位于Müller細(xì)胞中的酶〔20〕，由于這個(gè)過程是非常有效率的，所以Müller細(xì)胞對健康視網(wǎng)膜中的谷氨酸是免疫的〔21〕。嚴(yán)格地說，藥理的谷胺酰胺合成酶的抑制作用會導(dǎo)致動物在2 min內(nèi)失明〔21〕。然后，將谷氨酰胺運(yùn)回至光感受器內(nèi)，至此，整個(gè)循環(huán)過程結(jié)束〔22〕。Müller細(xì)胞也會為其他的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)傳遞轉(zhuǎn)運(yùn)體以及再循環(huán)系統(tǒng)，包括γ氨基丁酸和氨基乙酸〔2〕。

本研究的結(jié)果提示Müller細(xì)胞內(nèi)存在多個(gè)不同的信號傳導(dǎo)通路，這些信號通路間有交叉與關(guān)聯(lián)，它們共同決定著Müller細(xì)胞的生物學(xué)特性。

4 參考文獻(xiàn)

1Bringmann A,Pannicke T,Grosche J,etal. Muller cells in the healthy and diseased retina〔J〕.Prog Retinal Eye Res,2006; 25(4): 397-424.

2Bringmann A,Pannicke T,Biedermann B,etal. Role of retinal glial cells in neurotransmitter uptake and metabolism〔J〕.Neurochem Intern,2009;54(3-4): 143-60.

3Ames A. CNS energy metabolism as related to function〔J〕. Brain Res Brain Res Rev,2000;34(1-2): 42-68.

4Ames A 3RD,Li YY,Heher EC,etal. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport〔J〕. J Neurosci,1992;12(3): 840-53.

5Tsacopoulos M,Magistretti PJ. Metabolic coupling between glia and neurons〔J〕. J Neurosci，1996;16(3): 877-85.

6Poitry-Yamate CL,Poitry S,Tsacopoulos M. Lactate released by Muller glial cells is metabolized by photoreceptors from mammalian retina〔J〕.J Neurosci,1995;15(7 Pt 2): 5179-91.

7Winkler BS,Arnold MJ, Brassell MA,etal. Energy metabolism in human retinal Muller cells〔J〕. Inves Ophthalmol Vis Sci,2000; 41(10): 3183-90.

8Kuwabara T,Cogan DG. Retinal glycogen〔J〕. Arch Ophthalmol,1961;66(6):80-8.

9Sun Y, Wang D, Ye F. Elevated cell proliferation and VEGF production by high-glucose conditions in Müller cells involve XIAP〔J〕. Eye (Lond),2013;27(11):1299-307.

10Ye F, Che Y, Mcmillen E,etal. The effect of Scutellaria baicalensis on the signaling network in hepatocellular carcinoma cells〔J〕. Nutr Cancer,2009;61(4): 530-7.

11Peterson WM,Wang Q,Tzekova R,etal. Ciliary neurotrophic factor and stress stimuli activate the Jak-STAT pathway in retinal neurons and glia〔J〕.J Neurosci,2000;20(11): 4081-90.

12Wahlin KJ,Campochiaro PA,Zack DJ,etal. Neurotrophic factors cause activation of intracellular signaling pathways in Muller cells and other cells of the inner retina, but not photoreceptors〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000;41(3): 927-36.

13Joly S,Lange C, Thiersch M,etal. Leukemia inhibitory factor extends the lifespan of injured photoreceptors in vivo〔J〕. J Neurosci,2008;28(51): 13765-74.

14Bringmann A, Iandiev I, Pannicke T,etal. Cellular signaling and factors involved in Muller cell gliosis: neuroprotective and detrimental effects〔J〕. Prog Retinal Eye Res,2009;28(6): 423-51.

15Walsh N,Valter K,Stone J. Cellular and subcellular patterns of expression of bFGF and CNTF in the normal and light stressed adult rat retina〔J〕. Exp Eye Res,2001;72(5): 495-501.

16Wen R,Cheng T, Li Y,etal. Alpha 2-adrenergic agonists induce basic fibroblast growth factor expression in photoreceptors in vivo and ameliorate light damage〔J〕. J Neurosci,1996;16(19): 5986-92.

17Wassle H. Parallel processing in the mammalian retina〔J〕. Nature Rev Neurosci, 2004;5(10): 747-57.

18Thoreson WB, Witkovsky P. Glutamate receptors and circuits in the vertebrate retina〔J〕. Prog Retinal Eye Res,1999;18(6): 765-810.

19Beart PM, O'Shea RD. Transporters for L-glutamate: an update on their molecular pharmacology and pathological involvement〔J〕. Br J Pharmacol,2007;150(1): 5-17.

20Riepe RE,Norenburg MD. Muller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina〔J〕. Nature, 1977;268(5621): 654-5.

21Barnett NL,Pow DV, Robinson SR. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light 〔J〕. Glia, 2000;30(1): 64-73.

22Poitry S, Poitry-Yamate C,Ueberfeld J,etal. Mechanisms of glutamate metabolic signaling in retinal glial (Muller) cells〔J〕. J Neurosci, 2000;20(5): 1809-21.