白尚星

【摘要】目的觀察不同培養(yǎng)基對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)生物學(xué)特性的影響, 優(yōu)化培養(yǎng)方法。方法采用貼壁法從正常足月胎兒臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞, 細(xì)胞貼壁后利用DMEM/F12, Mesen PRORSTM Medium這兩種培養(yǎng)體系進(jìn)行體外擴(kuò)增, 繪制生長曲線, 流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志。結(jié)果從人臍帶中分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞為梭形, 呈平行排列生長或漩渦狀生長；細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44, 不表達(dá)CD34、CD45和HLA-DR。結(jié)論加入Mesen PRORSTM Medium培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度快, 更適合于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；臍帶；生物學(xué)特性

Influence of different mediums on biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cellBAI Shang-xing.Shenyang Sixth People's Hospital, Shenyang 110000, China

【Abstract】Objective?To investigate the differences of biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) in different mediums, and to optimize the purify methods. Methods?Mesenchymal stem cells were separated from healthy full-termed delivery fetus using tissue-adherent culture method. These cells were cultured and amplified in DMEM/F12 and Mesen PRORSTM Medium in vitro. The growth curve was drawn.Their surface markers were detected by flow cytometry. Results?Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord were spindle-shaped adherent cells.They have strong proliferation ability. The results of growth curve showed that compared with two medium, hUC-MSCs in Mesen PRORSTM Medium grew quickly at every time point. They were strongly positive expression for CD44 and CD29, but negative expression for CD34, CD45 and HLA-DR. Conclusion?Cell doubling time in the Mesen PRORSTM Medium was shorter than in DMEM/F12.

【Key words】Mesenchymal stem cell; Umbilical cord; Biological charateristics間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)來源于發(fā)育早期的中胚層, 是具有高度自我更新能力, 高度增殖能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞［1, 2］, 廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中［3］。臍帶為分娩廢棄物, MSC含量豐富, 無需有創(chuàng)穿刺即可獲得, 且較骨髓來源的MSC擴(kuò)增能力更強(qiáng), 成為近年來MSC研究的重要來源之一［4］。本研究采用兩種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)hUC-MSCs, 并對其進(jìn)行生物學(xué)特性的觀察、細(xì)胞免疫表型的鑒定, 以期建立一種穩(wěn)定、高效、快速、經(jīng)濟(jì)的hUC-MSCs富集方法, 為臨床細(xì)胞移植提供實驗支持。

1材料

1. 1臍帶選擇足月胎兒的臍帶, 產(chǎn)婦身體健康, 肝功能正常, 無傳染性疾病, 簽署知情同意書。臍帶4℃無菌保存, 4 h內(nèi)完成實驗操作。

1. 2主要試劑DMEM/F12, Mesen PRORSTM Medium和胰蛋白酶購自GibCO；胎牛血清(FBS)購自HyClone；鼠抗人抗體CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC購自BD。

2方法

2. 1人臍帶MSCs 的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增?臍帶剪成3~5 cm小段取出臍帶放入培養(yǎng)皿中, 用0.9%氯化鈉注射液沖洗, 洗盡血液。用手術(shù)剪剔除血管和外膜, 剪成2~3 mm小塊, 用0.9%氯化鈉注射液清洗一次, 用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗一次, 分成兩組：A組加入培養(yǎng)基(含50%Mesen PRORSTM Medium, 48% DMEM/F12和2%胎牛血清), B組加入培養(yǎng)基(DMEM/F12含 10%胎牛血清)放入250 ml培養(yǎng)瓶中, 組織塊密度要適中, 每瓶20 ml, 放置于37℃, 體積分?jǐn)?shù)5%CO2, 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察, 有少量成纖維狀細(xì)胞貼壁生長, 倒掉培養(yǎng)基和組織塊。添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng), 每3天換液, 細(xì)胞生長達(dá)80%以上時, 用胰酶消化, 按1：3傳代。

2. 2細(xì)胞生長曲線制作取生長良好的3代細(xì)胞, 按2×104/ml濃度接種24孔板, 每孔1 ml, 3 d換液一次, 以第2 d起每隔24小時計數(shù)3個孔細(xì)胞數(shù), 取其平均值, 繪制7 d的生長曲線。

2. 3hUC-MSCs表面標(biāo)記的檢測取3代細(xì)胞, 用0.25%胰酶消化, 用PBS洗滌2次, 制成l×106的細(xì)胞懸液, 每管加入100 μl, 設(shè)置陰性對照, 加入IgG1-FITC, 其它管加入20 μl鼠抗人HLA-DR-FITC、CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC, 室溫避光孵育30 min, 流式細(xì)胞儀計數(shù)5000~10000個細(xì)胞。

3結(jié)果

3. 1hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和純化兩組培養(yǎng)基原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種6~7 d, 除去組織塊, 倒置顯微鏡下可見有少量纖維狀的貼壁細(xì)胞, 2 d后形成散在的細(xì)胞集落, 大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞, 細(xì)胞折光性好, 14~18 d細(xì)胞集落增多, 細(xì)胞融合80%以上。(見圖lA-B)用0.25%胰酶消化傳代, 3代后可得到較為純化的間充質(zhì)干細(xì)胞, 傳代后的細(xì)胞增殖速度快, 約3~4 d可傳代1次。傳代后細(xì)胞形態(tài)較原代均一, 以平行排列生長或漩渦狀生長。兩組培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)相似, 無明顯差別。A組貼壁細(xì)胞較多, 細(xì)胞生長較快。

圖1人臍帶MSCs ( 倒置顯微鏡下) 的形態(tài)特征

3. 2hUC-MSCs生長曲線?傳代后的細(xì)胞第1~2天處于滯留期, 無明顯增殖。第3~5天進(jìn)入對數(shù)生長期, 細(xì)胞增殖加速達(dá)到高峰, 第6~7天進(jìn)入平臺期, A組細(xì)胞增殖快于B組細(xì)胞(見圖2)。

圖2人臍帶MSCs 的生長曲線

3. 3hUC-MSCs的表面標(biāo)志流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明, hUC-MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原標(biāo)志CD34、CD45, 強(qiáng)表達(dá)CD29和CD44, 不表達(dá)HLA-DR, 表明本實驗分離的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志；兩組培養(yǎng)基抗原表達(dá)無顯著差異。見表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

組別 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A組 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B組 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4討論

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中, 其中尤以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞更為原始, 分化能力和增殖能力強(qiáng), 且其來源于胚胎組織, 免疫原性更低［5］。臍帶中有2條動脈和1條靜脈, 包繞動靜脈的黏蛋白樣結(jié)締組織即為華通氏膠(Warthons jelly)。目前可從臍帶靜脈內(nèi)皮、內(nèi)皮下層、Warthons jelly、血管周圍組織以及羊膜來源的上皮組織等中分離得到MSCs ［6］。臍帶來源廣泛, 采集方便, 免疫排斥小, 倫理爭議小等優(yōu)點, 使其成為干細(xì)胞研究熱點, 在細(xì)胞治療中前景越來越廣闊。本實驗成功從人臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞, 獲得的原代細(xì)胞能夠連續(xù)傳代, 傳代后細(xì)胞純度提高, 形態(tài)較原代均一, 以平行排列生長為主, 或呈漩渦狀生長, 細(xì)胞能夠大量增殖, 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測, hUC-MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD45, 強(qiáng)表達(dá)CD29和CD44, 不表達(dá)HLA-DR說明其免疫原性極低, 符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點。用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的體系包括低糖DMEM、DMEM/F12和無血清培養(yǎng)體系。其中DMEM/F12是由DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按1：1混合組成的, 其營養(yǎng)成分豐富, 可以使用較少血清, 或作為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 適于原代細(xì)胞培養(yǎng)［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一種無血清培養(yǎng)基, 適合于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng), 但其價格昂貴, 不利于大量使用。本實驗在DMEM/F12培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入適量的Mesen PRORSTM Medium培養(yǎng)細(xì)胞, 結(jié)果表明, 能夠大量增殖細(xì)胞并且縮短培養(yǎng)時間, 還可以減少血清的用量, 減少移植輸注給患者時產(chǎn)生的不良反應(yīng)。因此, 無論從培養(yǎng)角度, 還是從臨床應(yīng)用考慮, 培養(yǎng)細(xì)胞時適量加入Mesen PRORSTM Medium都是較好的培養(yǎng)方式。

參考文獻(xiàn)

［1］ Caimi PF, Reese J, Lee Z, et al. Emerging therapeutic approaches for multipotent mesenehymal stromal cells. Curr Opin Hematol, 2010, 17(6):505-513.

［2］ Sun NZ, Ji H. In vitro diferentiation of osteocytes and adipocytes from human placenta-derived cels. J Int Med Res, 2012, 40(2):761-767.

［3］ Pendleton C, Li Q, Chesler DA, et al. Mesenchymal stem cell derived from adipose tissue vs bone marrow:in vitro comparison of their tropism towards gliomas. PLoS One, 2013, 8(3):58198.

［4］ Bongso A, Fong CY. The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R. Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 張茜真, 韓俊領(lǐng), 等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在3 種不同培養(yǎng)體系中的生長狀況及腺病毒感染效定.中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黃益民, 等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及多向分化潛能的研究. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］

圖2人臍帶MSCs 的生長曲線

3. 3hUC-MSCs的表面標(biāo)志流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明, hUC-MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原標(biāo)志CD34、CD45, 強(qiáng)表達(dá)CD29和CD44, 不表達(dá)HLA-DR, 表明本實驗分離的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志；兩組培養(yǎng)基抗原表達(dá)無顯著差異。見表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

組別 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A組 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B組 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4討論

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中, 其中尤以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞更為原始, 分化能力和增殖能力強(qiáng), 且其來源于胚胎組織, 免疫原性更低［5］。臍帶中有2條動脈和1條靜脈, 包繞動靜脈的黏蛋白樣結(jié)締組織即為華通氏膠(Warthons jelly)。目前可從臍帶靜脈內(nèi)皮、內(nèi)皮下層、Warthons jelly、血管周圍組織以及羊膜來源的上皮組織等中分離得到MSCs ［6］。臍帶來源廣泛, 采集方便, 免疫排斥小, 倫理爭議小等優(yōu)點, 使其成為干細(xì)胞研究熱點, 在細(xì)胞治療中前景越來越廣闊。本實驗成功從人臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞, 獲得的原代細(xì)胞能夠連續(xù)傳代, 傳代后細(xì)胞純度提高, 形態(tài)較原代均一, 以平行排列生長為主, 或呈漩渦狀生長, 細(xì)胞能夠大量增殖, 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測, hUC-MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD45, 強(qiáng)表達(dá)CD29和CD44, 不表達(dá)HLA-DR說明其免疫原性極低, 符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點。用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的體系包括低糖DMEM、DMEM/F12和無血清培養(yǎng)體系。其中DMEM/F12是由DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按1：1混合組成的, 其營養(yǎng)成分豐富, 可以使用較少血清, 或作為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 適于原代細(xì)胞培養(yǎng)［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一種無血清培養(yǎng)基, 適合于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng), 但其價格昂貴, 不利于大量使用。本實驗在DMEM/F12培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入適量的Mesen PRORSTM Medium培養(yǎng)細(xì)胞, 結(jié)果表明, 能夠大量增殖細(xì)胞并且縮短培養(yǎng)時間, 還可以減少血清的用量, 減少移植輸注給患者時產(chǎn)生的不良反應(yīng)。因此, 無論從培養(yǎng)角度, 還是從臨床應(yīng)用考慮, 培養(yǎng)細(xì)胞時適量加入Mesen PRORSTM Medium都是較好的培養(yǎng)方式。

參考文獻(xiàn)

［1］ Caimi PF, Reese J, Lee Z, et al. Emerging therapeutic approaches for multipotent mesenehymal stromal cells. Curr Opin Hematol, 2010, 17(6):505-513.

［2］ Sun NZ, Ji H. In vitro diferentiation of osteocytes and adipocytes from human placenta-derived cels. J Int Med Res, 2012, 40(2):761-767.

［3］ Pendleton C, Li Q, Chesler DA, et al. Mesenchymal stem cell derived from adipose tissue vs bone marrow:in vitro comparison of their tropism towards gliomas. PLoS One, 2013, 8(3):58198.

［4］ Bongso A, Fong CY. The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R. Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 張茜真, 韓俊領(lǐng), 等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在3 種不同培養(yǎng)體系中的生長狀況及腺病毒感染效定.中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黃益民, 等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及多向分化潛能的研究. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］

圖2人臍帶MSCs 的生長曲線

3. 3hUC-MSCs的表面標(biāo)志流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明, hUC-MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原標(biāo)志CD34、CD45, 強(qiáng)表達(dá)CD29和CD44, 不表達(dá)HLA-DR, 表明本實驗分離的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志；兩組培養(yǎng)基抗原表達(dá)無顯著差異。見表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

組別 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A組 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B組 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4討論

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中, 其中尤以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞更為原始, 分化能力和增殖能力強(qiáng), 且其來源于胚胎組織, 免疫原性更低［5］。臍帶中有2條動脈和1條靜脈, 包繞動靜脈的黏蛋白樣結(jié)締組織即為華通氏膠(Warthons jelly)。目前可從臍帶靜脈內(nèi)皮、內(nèi)皮下層、Warthons jelly、血管周圍組織以及羊膜來源的上皮組織等中分離得到MSCs ［6］。臍帶來源廣泛, 采集方便, 免疫排斥小, 倫理爭議小等優(yōu)點, 使其成為干細(xì)胞研究熱點, 在細(xì)胞治療中前景越來越廣闊。本實驗成功從人臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞, 獲得的原代細(xì)胞能夠連續(xù)傳代, 傳代后細(xì)胞純度提高, 形態(tài)較原代均一, 以平行排列生長為主, 或呈漩渦狀生長, 細(xì)胞能夠大量增殖, 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測, hUC-MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD45, 強(qiáng)表達(dá)CD29和CD44, 不表達(dá)HLA-DR說明其免疫原性極低, 符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點。用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的體系包括低糖DMEM、DMEM/F12和無血清培養(yǎng)體系。其中DMEM/F12是由DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按1：1混合組成的, 其營養(yǎng)成分豐富, 可以使用較少血清, 或作為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 適于原代細(xì)胞培養(yǎng)［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一種無血清培養(yǎng)基, 適合于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng), 但其價格昂貴, 不利于大量使用。本實驗在DMEM/F12培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入適量的Mesen PRORSTM Medium培養(yǎng)細(xì)胞, 結(jié)果表明, 能夠大量增殖細(xì)胞并且縮短培養(yǎng)時間, 還可以減少血清的用量, 減少移植輸注給患者時產(chǎn)生的不良反應(yīng)。因此, 無論從培養(yǎng)角度, 還是從臨床應(yīng)用考慮, 培養(yǎng)細(xì)胞時適量加入Mesen PRORSTM Medium都是較好的培養(yǎng)方式。

參考文獻(xiàn)

［1］ Caimi PF, Reese J, Lee Z, et al. Emerging therapeutic approaches for multipotent mesenehymal stromal cells. Curr Opin Hematol, 2010, 17(6):505-513.

［2］ Sun NZ, Ji H. In vitro diferentiation of osteocytes and adipocytes from human placenta-derived cels. J Int Med Res, 2012, 40(2):761-767.

［3］ Pendleton C, Li Q, Chesler DA, et al. Mesenchymal stem cell derived from adipose tissue vs bone marrow:in vitro comparison of their tropism towards gliomas. PLoS One, 2013, 8(3):58198.

［4］ Bongso A, Fong CY. The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R. Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 張茜真, 韓俊領(lǐng), 等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在3 種不同培養(yǎng)體系中的生長狀況及腺病毒感染效定.中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黃益民, 等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及多向分化潛能的研究. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］