王婷婷　王紅燦　路玉蓉等

摘要為建立一種有效的胰島移植免疫耐受的新方案，利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定未成熟樹(shù)突細(xì)胞（immature dendritic cells， imDCs），成骨誘導(dǎo)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs），雙硫腙（Dithizone， DTZ）染色鑒定胰島細(xì)胞.胰島細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療小鼠糖尿病，測(cè)定移植后糖尿病小鼠血糖及糖化血紅蛋白變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)未成熟樹(shù)突細(xì)胞共同移植雖然未能顯著延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間（7±2.65 d），但能顯著降低糖尿病小鼠血糖水平；200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞共移植，可使血糖下降到較低水平，并維持移植物存活時(shí)間達(dá)8±2.31天；200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞及2×105個(gè)未成熟樹(shù)突細(xì)胞共同移植于糖尿病小鼠，可使糖尿病鼠血糖下降并顯著延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間（12.6±3.48 d）.結(jié)果說(shuō)明聯(lián)合移植在一定程度上可延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間并使血糖維持在較低的水平，有效控制糖化血紅蛋白濃度，較單獨(dú)移植胰島細(xì)胞治療小鼠糖尿病有積極的作用.

關(guān)鍵詞樹(shù)突細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；胰島細(xì)胞移植；糖尿??；糖化血紅蛋白

20世紀(jì)70年代以來(lái)，胰島移植成為治療糖尿病的主要選擇之一 [13]，胰島移植細(xì)胞的質(zhì)量與數(shù)量是決定移植效果的關(guān)鍵，除了如何獲得高純度、高產(chǎn)量及高成活率的胰島細(xì)胞，胰島移植后無(wú)血管期以及后期的血管形成不良導(dǎo)致胰島丟失和胰島移植后效率低和免疫排斥也是目前亟需解決的問(wèn)題[4].有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）不僅可以產(chǎn)生促組織再生和修復(fù)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，防止糖尿病動(dòng)物體內(nèi)損傷的胰腺β細(xì)胞凋亡[5]，而且可以通過(guò)形成胰島細(xì)胞分泌胰島素并穩(wěn)定血糖水平 [68].體外研究則發(fā)現(xiàn)，MSCs可抑制T細(xì)胞的活化和各種刺激引起的T細(xì)胞增殖，并表明MSCs異體移植不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，還可誘導(dǎo)產(chǎn)生非特異性免疫耐受[9].未成熟樹(shù)突細(xì)胞（immature dendritic cell， imDCs）不表達(dá)共刺激分子，當(dāng)imDCs攜帶自身抗原移行至外周淋巴組織后不能使T細(xì)胞活化，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生自身耐受，相應(yīng)延長(zhǎng)異種胰島細(xì)胞在糖尿病小鼠體內(nèi)的存活時(shí)間[1011].在本研究中作者考察間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、未成熟樹(shù)突細(xì)胞（imDCss）與胰島細(xì)胞3種細(xì)胞不同移植方式在治療糖尿病鼠中的治療效果，建立一種胰島移植治療糖尿病鼠免疫耐受的新方案，為臨床開(kāi)展胰島移植治療糖尿病提供有益的探索.

1材料與方法

1.1材料

BALB/c小鼠（6周齡），SD大鼠（270 g）均購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；胎牛血清（GIBCO）；RPMI1640，DMEM/F12培養(yǎng)基，HBSS，青霉素和鏈霉素均購(gòu)自HYCLONE；MTT及DMSO均購(gòu)自上海生物工程有限公司；淋巴細(xì)胞分離液（Histopaque1.077 g/mL），膠原酶V，鏈脲佐菌素（STZ），雙硫腙（DTZ）及吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）均購(gòu)自SIGMA；Rat INS （Insulin） ELISA Kit 購(gòu)自Elabscience；小鼠糖化血紅蛋白（HbA1c）ELISA Kit購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；AntiMouse CD11c FITC，AntiMouse CD86 FITC，AntiMouse CD80 FITC，AntiMouse MHCⅡ FITC，Rat IgG2b K Isolype Control FITC，Armenian Hamster IgG Isotype Control FITC，Rat IgG2a K Isotype Control FITC均購(gòu)自EBIOSCIENCE；重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinant mice granulocyte macrophage colony stimulating factor，rmGMCSF和重組小鼠白介素4 （recombinant mice interleukin4，rmIL4） 購(gòu)自PEPROTECH；血糖儀及血糖試紙為羅氏ACCUCHEK Performa.流式細(xì)胞儀為BD；酶標(biāo)儀為BioTek.

1.2方法

1.2.1間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)取6～8周齡的雄性BALB/c小鼠斷頸處死，無(wú)菌取出雙側(cè)的股骨和脛骨，剔凈周圍組織，后用DMEM/F12培養(yǎng)基（含1%青霉素/鏈霉素）沖洗.剪掉兩端膨大關(guān)節(jié)，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基沖洗髓腔，至髓腔變白.沖洗液經(jīng)74 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液并離心，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2～5×106 /mL，用6孔板培養(yǎng).將培養(yǎng)板放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，3 h后，換液，去除不貼壁的細(xì)胞.此后，每8 h換液一次，棄去未貼壁細(xì)胞，直至72 h（從初始培養(yǎng)算起）.以后每3 d換液一次，待細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化并傳代，繼續(xù)放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取純化的第3代MSC接種于24孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)，換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d換液一次，以含10%FBS的DMEM/F12為對(duì)照.37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).誘導(dǎo)2周后，ALP鈣鈷法染色，誘導(dǎo)3周的細(xì)胞，Von kossas礦化染色.

1.2.2未成熟樹(shù)突細(xì)胞（imDCss）的分離培養(yǎng)和鑒定取6～8周齡的雄性BALB/c小鼠斷頸處死，無(wú)菌取出雙側(cè)的股骨和脛骨，剔凈周圍組織，用RPMI1640 培養(yǎng)基沖洗，減掉兩端膨大關(guān)節(jié)，用培養(yǎng)基沖洗髓腔，至髓腔變白，沖洗液經(jīng)74 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液離心，收集細(xì)胞.加入1mL細(xì)胞裂解液，輕輕拍打30～60 s后立即加入50 mL冷的PBS稀釋裂解液，離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106 /mL.

收集的細(xì)胞用含10%FBS的RMPI1640培養(yǎng)基（含1%青霉素/鏈霉素），37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).同時(shí)培養(yǎng)基中加入20 μg/L Recombinant Mouse GMCSF，10 μg/L Recombinant Mouse IL4；第3天和第5天半量換液，補(bǔ)充GMCSF和IL4至全量，培養(yǎng)到第7天，進(jìn)行流式鑒定，鑒定的抗體表型分別為CD11c，MHCⅡ，CD86，CD80.

1.2.3大鼠胰島細(xì)胞的分離純化及活力檢測(cè)將成年SD大鼠（8～10周齡，體重250～300 g）用戊巴比妥鈉麻醉；打開(kāi)腹腔，結(jié)扎胰管；經(jīng)膽總管向胰腺注入膠原酶V溶液（1 g/L） 8～10 mL，摘取胰腺，37.5℃水浴20 min后終止消化，通過(guò)045 mm篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞.洗滌后用Histopaque@1077純化獲得胰島細(xì)胞；收集細(xì)胞，再洗滌，取5 mL胰島懸液雙硫腙（DTZ）染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，并進(jìn)行胰島當(dāng)量計(jì)數(shù)和純度分析.重復(fù)3次，分別鏡檢計(jì)數(shù)雙硫腙（DTZ）陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán).胰島當(dāng)量=（3次陽(yáng)性胰島數(shù)值之和/3）×[樣本總量（mL） / 50 μL]，胰島的純度=DTZ染色陽(yáng)性的胰島個(gè)數(shù)/細(xì)胞團(tuán)總數(shù)×100%，此實(shí)驗(yàn)中胰島的純度=紅色 / （紅色+黃色）×100%.

以無(wú)酚紅Hanks液配置AO儲(chǔ)存液及PI儲(chǔ)存液，避光4 ℃保存.使用前，稀釋成規(guī)定的濃度，活的胰島細(xì)胞經(jīng)AO/PI染色呈綠色，死亡的胰島細(xì)胞經(jīng)AO/PI染色呈紅色.拍照并用ImagePro plus軟件分析胰島細(xì)胞活力.胰島的活力=綠色/（紅色+綠色）×100%.

1.2.4葡萄糖刺激胰島細(xì)胞胰島素釋放濃度的測(cè)定用含2.8 mmol/L葡萄糖和16.8 mmol/L葡萄糖的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，將分離純化后的胰島細(xì)胞接種于24孔板，每孔約100 IEQs胰島細(xì)胞，37 ℃各孵育2 h，分別收集培養(yǎng)液保存，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中胰島素的含量.刺激指數(shù)（Stimulation Index，SI）=16.8 mmol/L葡萄糖刺激下的胰島素濃度/2.8 mmol/L葡萄糖刺激下的胰島素濃度.

1.2.5體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）及MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖影響以SD大鼠外周血T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞（R），分別將絲裂霉素C（40 mg/L）處理的 MSCs，imDCs，imDCs+MSCs作為刺激細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，將一定濃度的反應(yīng)細(xì)胞與相應(yīng)濃度的刺激細(xì)胞（S）（S與R數(shù)目比為1∶〖KG-2mm〗10）加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL 10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔， 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天.終止反應(yīng)前4 h，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，4 h后，離心棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀（BIOTEK）570 nm處測(cè)定吸光度.并計(jì)算其刺激指數(shù)（SI）=實(shí)驗(yàn)組OD570吸光度/對(duì)照組OD570吸光度.

1.2.6小鼠糖尿病模型的建立以pH 4.5的0.1 mol/L檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液配置12 g/L鏈脲佐菌素（STZ）溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后置冰上備用.BALB/c小鼠，雄性，8～10周齡，75%酒精常規(guī)消毒腹部皮膚，150 mg/kg體重腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液.注射72 h后開(kāi)始測(cè)定血糖，連續(xù)測(cè)定5 d，每天血糖都維持16.7 mmol/L以上為造模成功.

1.2.7實(shí)驗(yàn)分組及術(shù)后血糖、糖化血紅蛋白檢測(cè)將8～10周齡的糖尿病雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，接受胰島與同源未成熟樹(shù)突細(xì)胞（imDCs）或間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的移植.糖尿病小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，在背部肋下皮膚處做一小切口，以無(wú)菌棉簽擠壓暴露左腎.A組（n=5）：糖尿病模型對(duì)照組，未移植細(xì)胞；B組（n=6）：200個(gè)胰島移植于糖尿病小鼠左腎被膜下；C組（n=6）：200個(gè)胰島與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植于糖尿病小鼠左腎被膜下；D組（n=6）：200個(gè)胰島及2×105個(gè)未成熟樹(shù)突細(xì)胞（imDCs）移植于糖尿病小鼠左腎被膜下；E組（n=5）：將200個(gè)胰島、2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）及2×105個(gè)未成熟樹(shù)突細(xì)胞（imDCs）共同移植于糖尿病小鼠左腎被膜下.移植后，尾靜脈采血檢測(cè)血糖值，移植后連續(xù)兩次血糖水平>11.1 mmol/L定義為發(fā)生移植排斥反應(yīng)，連續(xù)兩次血糖水平>16.7 mmol/L定義為移植物失功.

移植后，每4 d小鼠眼眶取血ELISA法測(cè)定糖化血紅蛋白（HbA1c）濃度.糖化血紅蛋白的濃度：HBA1C%=HbA1c（g/dl）/Hb（g/dl） ×100%.糖化血紅蛋白為4%～6%時(shí)定義為血糖控制正常；6%～7%為血糖控制比較理想；7%～8%定義為血糖控制一般；8%～9%定義為控制不理想；糖化血紅蛋白>9%定義為血糖控制很差. ADA（美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)）建議糖化血紅蛋白控制在小于7%，IDF（國(guó)際糖尿病聯(lián)盟）建議糖化血紅蛋白控制標(biāo)準(zhǔn)為小于6.5%，目前我國(guó)將糖尿病患者糖化血紅蛋白的控制標(biāo)準(zhǔn)定為6.5%以下.采用〖HJ1.5mm〗SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)意義.

2結(jié)果與分析

2.1MSCs形態(tài)觀察及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定

骨髓細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)72 h后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞形態(tài)不均一，有成纖維樣細(xì)胞，也有小的圓形細(xì)胞等[圖1A（彩圖見(jiàn)封三）].一周后主要以梭樣細(xì)胞為主，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)均一（圖1B，第三代），表現(xiàn)出典型的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）形態(tài).對(duì)傳代培養(yǎng)第三代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，鑒定所分離細(xì)胞為MSCs，顯微鏡下可見(jiàn)：鈣鈷法染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)有大量褐色沉淀， ALP呈陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖1C）；Von kossas礦化染色可見(jiàn)細(xì)胞聚集處有黑色骨塊，島狀分布（見(jiàn)圖1D）.

2.2imDCs形態(tài)觀察及表面標(biāo)志測(cè)定

利用BALB/c小鼠骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞，3 h后只保留貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)3 d即可見(jiàn)大量集落形成[圖2A（彩圖見(jiàn)封三）]，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞體積、形態(tài)變化，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面產(chǎn)生不規(guī)則的毛刺狀突起（圖2B）.經(jīng)流式細(xì)胞儀分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓未成熟樹(shù)突細(xì)胞高表達(dá)CD11c（89.9%），中度表達(dá)MHCⅡ（36.61%），低表達(dá)CD80 （5.03%）和CD86 （1.5%）（見(jiàn)圖3），符合imDCs表面標(biāo)志物的特征.

2.3大鼠胰島細(xì)胞的形態(tài)觀察及活性檢測(cè)

顯微鏡下觀察純化后的胰島細(xì)胞形態(tài)如圖4A（彩圖見(jiàn)封三）；胰島細(xì)胞經(jīng)DTZ染色見(jiàn)圖4B，胰島細(xì)胞呈猩紅色，外分泌細(xì)胞不會(huì)被DTZ染色而呈黃色，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)純化前分離的大鼠胰腺胰島純度為4.5%±15%，純化后為67%±9.85%；純化后胰島細(xì)胞AO/PI染色結(jié)果見(jiàn)圖4C，其中活細(xì)胞被染成綠色，而死亡的胰島細(xì)胞呈紅色，選擇4個(gè)不同的視野進(jìn)行拍照，Imagepro plus 6.0分析胰島純化后的細(xì)胞存活百分比，即胰島的活力，本研究中作者共分析了4例大鼠胰腺分離純化后活力，結(jié)果如圖4D所示，純化后獲得的胰島存活率平均為（91±3）%.

2.4葡萄糖刺激分離的胰島細(xì)胞胰島素釋放濃度

ELISA法檢測(cè)不同濃度葡萄糖刺激胰島細(xì)胞后胰島素釋放水平，結(jié)果如圖5所示，分離的大鼠胰島細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下對(duì)葡萄糖的刺激仍具有良好的胰島素釋放能力，SI為2.53±0.29.

2.5imDCs與MSCs對(duì)MLR中T淋巴細(xì)胞抑制作用

分別比較imDCsT細(xì)胞共培養(yǎng)組和MSCsT細(xì)胞共培養(yǎng)組以及imDCs+MSCsT細(xì)胞共培養(yǎng)組中T細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)imDCs+MSCsT細(xì)胞共培養(yǎng)組對(duì)T細(xì)胞刺激顯著低于其他各組，MTT檢測(cè)分析表明imDCs+MSCs對(duì)T細(xì)胞刺激能力低，并能顯著抑制T細(xì)胞的增殖（SI=1.15±0.12，P<0.05），結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組（mDCsT細(xì)胞共培養(yǎng)組）相比，imDCsT細(xì)胞（SI=1.58±0.18），MSCsT細(xì)胞（SI=1.66±013），說(shuō)明imDCs與MSCs均對(duì)T細(xì)胞增殖有抑制作用，而imDCs+MSCs對(duì)T細(xì)胞的抑制效果更明顯.

2.6移植后血糖水平檢測(cè)

移植后各組小鼠血糖檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組相比，僅200個(gè)胰島細(xì)胞移植后小鼠血糖很快降低，在較低水平維持5 d后開(kāi)始升高，移植7 d后血糖水平高于11.1 mmol/L，且呈持續(xù)上升趨勢(shì)，10 d后血糖值高于16.7 mmol/L；200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞共移植組中，移植后第三天小鼠血糖降至5.4±1.25 mmol/L，并維持在較低水平，直至移植14 d后，血糖值高于16.7 mmol/L，但其血糖維持在降低水平的時(shí)間相較于胰島移植組略長(zhǎng)（8±2.31 d）； 200個(gè)胰島同2×105個(gè)未成熟樹(shù)突細(xì)胞共同移植于糖尿病鼠可使糖尿病鼠血糖下降，并較長(zhǎng)時(shí)間地維持血糖于較低水平（7±2.65 d），第11天血糖水平（12.48 mmol/L）低于胰島細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞移植的血糖水平（15.63 mmol/L），具有顯著差異（P﹤0.05），且從第8天起血糖水平整體低于間充質(zhì)干細(xì)胞和胰島細(xì)胞移植組.200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞、2×105個(gè)未成熟樹(shù)突細(xì)胞共同移植，可以更長(zhǎng)時(shí)間地維持血糖處于較低水平（12.6±3.48 d），且從第7天開(kāi)始其血糖水平均低于其他各組，綜上說(shuō)明聯(lián)合移植可以延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間.

2.7移植后糖化血紅蛋白檢測(cè)

糖化血紅蛋白（HbA1c）是血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，血糖和血紅蛋白的結(jié)合生成糖化血紅蛋白是不可逆反應(yīng)，并與血糖濃度成正比，檢測(cè)糖化血紅蛋白能更好地監(jiān)控血糖的控制情況，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ELISA法檢測(cè)血液中糖化血紅蛋白（HbA1c），結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組相比，各移植組在移植后12天內(nèi)糖化血紅蛋白水平都控制良好，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明胰島移植能有效控制糖尿病小鼠血糖水平；但隨著時(shí)間的推移，小鼠HbA1c水平呈上升趨勢(shì)，血糖控制效果日益減低，移植后第16天的檢測(cè)結(jié)果顯示，B，C，D實(shí)驗(yàn)組HbA1c均大于7%，第20天僅胰島移植組HbA1c為（8.1±0.56）%，血糖控制效果不理想；而D組移植后第16天（（7.3±0.43）%，P<0.05）和第20天（（7.0±0.43）%，P<0.05）的檢測(cè)結(jié)果表明，D組控制血糖效果較B，C組均好；E組自移植后16天糖化血紅蛋白一直控制在6.5%以下（P<001），且HbA1c值穩(wěn)定，直至第20天，為（6.6±0.41）%，說(shuō)明胰島細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞、未成熟樹(shù)突細(xì)胞聯(lián)合移植血糖控制效果較好，且明顯優(yōu)于其他組.

3討論

糖尿病模型鼠移植同種異體胰島細(xì)胞可以達(dá)到降低血糖的目的，但由于移植后的免疫排斥致使治療效果不能長(zhǎng)久維持，移植不久血糖就會(huì)升高.樹(shù)突細(xì)胞因其在機(jī)體免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)中諸多的特殊作用而受人們關(guān)注.其中，未成熟樹(shù)突細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受能使移植器官在不使用免疫抑制劑的情況下長(zhǎng)期存活被認(rèn)為是一種防治移植排斥反應(yīng)的有效方法[1213].本文將胰島細(xì)胞與未成熟樹(shù)突細(xì)胞（imDCs）混合移植于糖尿病小鼠，發(fā)現(xiàn)移植物的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)并維持血糖在較低水平，糖化血紅蛋白控制效果良好，證實(shí)了未成熟樹(shù)突細(xì)胞的免疫耐受功能，但在移植一段時(shí)間后，血糖水平升高并恢復(fù)高血糖狀態(tài)，移植物功能減退，其可能原因是未成熟樹(shù)突細(xì)胞體內(nèi)刺激成熟，因此體內(nèi)如何長(zhǎng)期維持樹(shù)突細(xì)胞的未成熟或耐受狀態(tài)仍是一個(gè)難題.有研究發(fā)現(xiàn)移植間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）可以降低I型及Ⅱ糖尿病的血糖值，并推測(cè)其降低血糖的機(jī)制可能是促進(jìn)胰島細(xì)胞再生、免疫調(diào)節(jié)以及提高胰島的敏感性[1415].許多研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分泌的細(xì)胞因子EGF和HGF對(duì)β細(xì)胞的增加和凋亡至關(guān)重要，還分泌VEGF等促進(jìn)移植物新生血管形成，增加細(xì)胞間的血管密度[1618].Gao 發(fā)現(xiàn)移植的MSCs在糖尿病動(dòng)物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)移到胰腺，促進(jìn)β細(xì)胞再生和修復(fù)，在體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞可以使胰島細(xì)胞增加PAkt和PErk的表達(dá).在體外，胰島細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)也可使PAkt和PErk的表達(dá)量增加，而Akt和Erk又是β細(xì)胞增值的主要調(diào)節(jié)者[19].本文也證實(shí)胰島與骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）混合移植可以延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間并使血糖維持在較低的水平，但其具體的作用機(jī)制尚待深入研究，作者推測(cè)β細(xì)胞的再生可能是通過(guò)復(fù)制先前存在的β細(xì)胞或通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）在胰腺細(xì)胞的組織再生.

研究報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞不僅可抑制單核細(xì)胞向樹(shù)突細(xì)胞的分化，抑制樹(shù)突細(xì)胞的成熟，還能產(chǎn)生多種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子包括抑制未成熟樹(shù)突細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子.如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的TSG6可抑制骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞成熟[20]，分泌IL6參與調(diào)控未成熟樹(shù)突細(xì)胞保持不成熟的細(xì)胞表型[21]，此外，還分泌PGE2參與調(diào)控單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)突細(xì)胞[22].間充質(zhì)干細(xì)胞還可減少成熟樹(shù)突細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，減少IL12的產(chǎn)生，減少T細(xì)胞的激活[20].另有研究表明MSCDC發(fā)揮抑制作用是通過(guò)細(xì)胞直接接觸作用而非通過(guò)分泌可溶因子[23]，而PDL1（programmeddeath ligands 1）是表達(dá)于樹(shù)突細(xì)胞上的B7家族分子，可通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)其受體PD1并與其結(jié)合引發(fā)下游反應(yīng)而誘導(dǎo)T細(xì)胞分化或失能等，而且imDCs對(duì)T細(xì)胞活化的影響與imDCs上表達(dá)的PDL1有關(guān)[2425].本實(shí)驗(yàn)利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）及MTT檢測(cè)法分析體外imDCs與MSCs對(duì)同源異體T細(xì)胞刺激活化影響，發(fā)現(xiàn)imDCs與MSCs均能有效抑制T細(xì)胞增殖，而且imDCs與MSCs聯(lián)合對(duì)T細(xì)胞的抑制效果最為明顯， MSCs，imDCs，imDCs+MSCs聯(lián)合胰島移植治療糖尿病能夠有效維持血糖低水平的可能機(jī)制是這些細(xì)胞影響了T細(xì)胞的活化及增殖，而imDCs+MSCs更加強(qiáng)了對(duì)T細(xì)胞的抑制效果，而imDCs+MSCs與T細(xì)胞的抑制效果是否與PDL1分子相關(guān)尚需進(jìn)一步研究.

作者通過(guò)建立的高質(zhì)量、高數(shù)量胰島細(xì)胞的分離系統(tǒng)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、未成熟樹(shù)突細(xì)胞（imDCs）與胰島細(xì)胞一起移植于糖尿病小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島移植物的存活時(shí)間相較于胰島細(xì)胞與imDCs或胰島細(xì)胞與MSCs混合移植均延長(zhǎng)，且其降低血糖的效果顯著改善，糖化血紅蛋白控制效果最為理想，對(duì)胰島功能重建、血糖長(zhǎng)期穩(wěn)定控制以及免疫耐受均有一定借鑒意義.

參考文獻(xiàn)：

[1]范亞平， 劉開(kāi)甄. 1型糖尿病的免疫耐受治療[J]. 國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志， 2011，31（5）：337339.

[2]簡(jiǎn)優(yōu)強(qiáng)， 周漢新， 李富榮.免疫抑制或免疫耐受在胰島移植中的作用[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志， 2012，28（2）：1923.

[3]蔡寒青. 胰島移植治療糖尿病的臨床前研究[D]. 北京： 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)， 2008.

[4]傅藝凌. 異種胰島移植中巨噬細(xì)胞免疫排斥及調(diào)節(jié)的研究[D]. 濟(jì)南： 山東大學(xué)， 2007.

[5]COURI C E. Stem cell transplantation for type 1 diabetes mellitus [J]. Diabetol Metab Sypdr， 2009，1（1）：14.

[6]GAO X D， SONG L J， SHEN K T， et al. Bone marrow mesenchymal stem cells promote the repair of islets from diabetic mice through paracrine actions [J]. Mol Cel Endocrinol， 2014， 388（1/2）： 4150.

[7]OH S H， MUZZONIGRO T M， BAE S H， et al. Adult bone marrowderived cells trans differentiating into insulinproducing cells for the treatment of type I diabetes [J]. Lab Invest， 2004，84（5）：607617.

[8]CHEN L B， JIANG X B， YANG L. Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet betacells [J].World J Gastroenterol， 2004，10（20）：30163020.

[9]SIMS E， EVANSMOLINA C. Stem cells as a tool to improve outcomes of islet transplantation [J]. J Transplant， 2012，2012：736491.

[10]YAO V， PLATELL C， HALL J C. Dendritic cells [J]. ANZ J Sung， 2002，72（7）：501506.

[11]THOMSON A W， OCONNELL P J， STEPTOE R J， et al. Immunobiology of liver dendritic cells [J]. Immunol Cell Biol， 2002，80（1）：6573.

[12]XIAO L， JOO KI， LIM M， et al. Dendritic celldirected vaccination with a lentivector encoding PSCA for prostate cancer in mice [J]. PLOS One， 2012，7（11）：e48866.

[13]LOTT D G， DAN O， LU L， et al. Decoy NFkappa B fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells [J]. Laryngoscope， 2010，120（1）：4452.

[14]FIGLIUZZI M， CORNOLTI R， PERICO N， et al. Bone marrowdrived mesenchymal stem cells improve islet function in diabetic rats [J].Transplant Proc， 2009，41（5）：17971800.

[15]高峰， 李國(guó)良， 林雨佳， 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植途徑對(duì)胰島移植物免疫排斥反應(yīng)的影響[J]. 中國(guó)普通外科雜志， 2012，9（12）：10801085.

[16]SAKATA N， CHAN N K， CHRISLER J， et al. Bone marrow cell cotransplantation with islets improves their vascularization and function [J]. Transplantion， 2010，89（6）：686693.

[17]DING Y， XU D， FENG G， et al. Mesenchymal stem cells prevent the rejection of fully allogenic islet grafts by the immunosuppressive activity of matrix metalloproteinase-2 and -9 [J]. Diabetes， 2009，58（8）：17971806.

[18]周華， 王默， 金星， 等. 間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因治療兔肢體缺血[J]. 中國(guó)普通外科雜志， 2011，20（12）：13421346.

[19]GAO X D， SONG L J， SHEN K T， et al. Bone marrow mensenchymal stem cells promote the repair of islets from diabetic mice though paracrine actions [J]. Mol Cell Endocrinol， 2014，388（1/2）：4150.

[20]LIU Y， YIN Z L， ZHANG R， et al. MSCs inhibit bone marrowderived DC maturation and function through the release of TSG6 [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2014，450（4）：14091415.

[21]DJOUAD F， CHARBONNIER L M， BOUFFI C. Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an interleukin6dependent mechanism [J]. Stem Cells， 2007，25（8）：20252032.

[22]SPAGGIARI G M， ABDELRAZIK H， BECCHETTI F， et al. MSCs inhibit monocytederived DC maturation and function by selectively interfering with the generation of immature DCs： central role of MSCderived prostaglandin E2 [J]. Blood， 2009，113（26）：65766583.

[23]ZHANG B， LIU R， SHI D， et al. Mesenchymal stem cells induce mature dendritic cells into a novel Jagged2dependent regulatory dendritic cell population [J]. Blood， 2009，113（1）：4657.

[24]CHEN C， QU Q X， ZHANG X G， et al. Expression of programmeddeath receptor ligands 1 and 2 may contribute to the poor stimulatory potential of murine immature dendritic cells [J]. Immunobiology， 2007，212（3）：159165.

[25]BROWN J A， DORFMAN D M， MA F R. Blockade of programmed death1 ligands on dendritic cells enhances T cell activation and cytokine production [J]. J Immunol， 2003，170（3）：12571266.