方 日 謝金龍 王小文 顏嬌貴

腫瘤細(xì)胞在相關(guān)因素誘導(dǎo)下，突破基膜大量生長繁殖并且促進新生血管分化，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又稱為CD1)同腫瘤細(xì)胞黏附、浸潤生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)[1]。各類炎癥性疾病同CD31基因多態(tài)性具有一定的關(guān)聯(lián)[2]。在此次研究中，我們通過聚合酶鏈反應(yīng)及限制性片段長度態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，研究CD31基因單核苷酸Gly670Arg(C2008T)、Asn563Ser(T1688C)和Leu125Va(C373G)的多態(tài)性及血清水平與肝細(xì)胞肝癌的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2009年3月-2012年6月，本院普外科收治入院的原發(fā)性肝癌患者160例歸為肝癌組，其中男性113例，女性47例，年齡28.3～63.5歲，平均為(45.6±7.4)歲。肝細(xì)胞肝癌的診斷均滿足世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并且都經(jīng)過CT和病理活檢確診。選取同期在本院接受體檢的健康對照者160例歸為對照組，其中男性107例，女性53例，年齡26.5～59.7歲，平均為(43.5±6.9)歲。160例健康對照組經(jīng)常規(guī)體檢，各項指標(biāo)和臨床癥狀均正常，無家族遺傳病史。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因組的DNA 收集清晨2 ml的靜脈血，提取白細(xì)胞的基因組DNA時，采用福州邁新生物技術(shù)公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒，并在-70℃的環(huán)境中保存留作備用。

1.2.2 PCR引物的設(shè)計和擴增 以Genbank公布的基因序列(NC_000017)為參考設(shè)計出3對引物，由上海信然生物技術(shù)有限公司合成。進行特異性擴增的CD31基因包含Leu125Val位點的一段DNA引物序列，其上游引物為：5’-GCTCCATCTGCTTGCCTGT-3’；下游引物為：5’-TGTCAGCACCACCTCTCACG-3’。進行特異性擴增CD31基因包括Ser563Asn位點的一段DNA引物序列，上游引物為：5’-TGGAGACCCTGACTCACCTC-3’；下游引物為：5’-TGCAATGTGCTGTGAATGAA-3’。進行特異性擴增CD31基因包含Arg670Gly位點的一段DNA引物序列，上游引物為：5’-TGGGAAATIATCCACAGTCCTTCA-3’；下游引物為：5’-CAACTAGGTCACAATGACGATGCC-3’。CD31的PCR擴增反應(yīng)體系均為25 μl，包括10×PCR緩沖液2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μl，上、下游引物各為20 pmol，模板DNA 2.0 μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，不足部分的體積用滅菌蒸餾水補足到25 μl。置于熱循環(huán)儀(Bio-Rad)中94 ℃預(yù)變性5 min；再根據(jù)下列步驟循環(huán)35次，即94 ℃變性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；末次循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。

1.2.3 特異性擴增的CD31基因限制性酶切 選取經(jīng)過PCR擴增的產(chǎn)物2 μl，分別采用2 U限制性內(nèi)切酶PvuⅡ、NheⅠ和MspⅠ(日本寶生物TAKARA公司)酶切CD31基因Ser563Asn、Arg670Gly和Leu125Val位點，于37 ℃保溫箱孵育3 h后，待反應(yīng)中止后，剩余片段在8%的聚丙稀酰胺凝膠上電泳，然后EB染色，判斷電泳結(jié)果。

1.2.4 檢測血清CD31含量 通過酶聯(lián)免疫吸附實驗測定CD31的血清含量，試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照使用說明進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CD31的基因型分析

2.1.1 CD31基因Leu125Val的多態(tài)性 經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)擴增的產(chǎn)物片段長度為245 bp，并依據(jù)限制性內(nèi)切酶PvuⅡ酶切片段的狀況，可將其基因型分為3種，Leu/Leu型(245 bp，1條帶)，Leu/Val型(245 bp，193 bp，52 bp 3條帶；52 bp電泳帶已經(jīng)跑出膠外)，Val/Val型(193 bp，52 bp 2條帶；52 bp電泳帶也已經(jīng)跑出膠外)。

2.1.2 CD31基因Ser563Asn多態(tài)性 經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)擴增的產(chǎn)物片段長度為236 bp，并依據(jù)限制性內(nèi)切酶NheI酶切片段的狀況，可將其基因型分為3種：Asn/Asn型(236 bp 1條帶)，Ser/Asn型(236 bp，127 bp，109 bp 3條帶)，Ser/Ser型(127 bp，109 bp 2條帶)。

2.1.3 CD31基因Arg670Gly多態(tài)性 經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)擴增的產(chǎn)物片段長度為165 bp，并依據(jù)限制性內(nèi)切酶MspI酶切片段的狀況，可將其基因型分為3種，Arg/Arg型(165 bp 1條帶)，Gly/Arg型(165 bp，140 bp，25 bp 3條帶，25 bp電泳帶已經(jīng)跑出膠外)，Gly/Gly型(140 bp，25 bp 2條帶；25 bp電泳帶已經(jīng)跑出膠外)。

2.2 對照組與肝癌組CD31基因單核苷酸多態(tài)性分布頻率的對照

CD31的基因型在2組人群中的分布頻率，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，符合遺傳平衡的標(biāo)準(zhǔn)，滿足群體代表性。通過χ2檢驗及相關(guān)數(shù)據(jù)分析，CD31基因Leu125Val位點基因型在2組人群中的分布中具有顯著的差異(χ2=10.875，P<0.05)；等位基因頻率在2組人群中的分布也具有顯著的差異(χ2=10.534，P<0.05)。通過分析等位基因頻率的相對風(fēng)險，可以發(fā)現(xiàn)，Val等位基因的攜帶者患肝癌的風(fēng)險為Leu等位基因的1.457倍(OR=1.457，95%CI：1.187～2.186)；CD31基因Gly670Arg和Asn563Ser的單核苷酸多態(tài)性在2組人群中的分布沒有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.3 2組人群中CD31血清含量的對比

肝癌組患者血清CD31含量為(85.4±35.8)，顯著高于對照組(58.7±20.5)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.187，P<0.01)。

2.4 CD31基因的單倍型和連鎖不平衡分析

通過對CD31基因3個位點(Leu125Val、Arg670Gly和Ser563Asn)的單核苷酸多態(tài)性進行連鎖不平衡分析，結(jié)果表明這3個位點的單核苷酸多態(tài)性具有非常強烈的連鎖不平衡。結(jié)合對基因型的研究分析進一步表明，Val-Ser-Arg基因單倍型攜帶者與對照組相比，患肝癌的風(fēng)險較高(OR=1.487，95%CI：1.092-2.038)。見表2。

表1 對照組與肝癌組CD31基因單核苷酸多態(tài)性分布頻率的對照/例

表2 CD31基因的單倍型和連鎖不平衡分析(例，%)

3 討論

原發(fā)性肝癌在發(fā)生和發(fā)展的過程中常常會由于抑癌基因或者癌基因發(fā)生突變[4-5]，從而導(dǎo)致相關(guān)因子無法表達(dá)或者表達(dá)紊亂。有研究表明[6-7]，遺傳因素在原發(fā)性肝癌的發(fā)病中起到重要作用，部分致病基因逐步被發(fā)現(xiàn)，但具體的致病機理尚未完全研究透徹。

血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(PECAM-1，又稱為CD1)屬于黏附分子免疫球蛋白超家族的重要部分，同腫瘤細(xì)胞黏附、浸潤生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)[8-9]，其大部分由血小板或者血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)、合成和分泌。當(dāng)腫瘤細(xì)胞突破基質(zhì)浸潤生長時，與血小板相互接觸和作用后，產(chǎn)生一系列活性介質(zhì)，有助于腫瘤細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮上[10]。CD31是由15個內(nèi)含子和16個外顯子構(gòu)成，位于17號染色體長臂上(17q23)，其存在T1688C、C2008T和C373G 3種單核苷酸多態(tài)性，位于第8、12和第3位外顯子上[11]，分別會導(dǎo)致Gly670Arg、Asn563Ser和Leu125Val氨基酸發(fā)生一系列的變化改變，進而會影響CD31基因翻譯、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，繼而改變其在機體內(nèi)的功能和作用，最終體現(xiàn)在引起一系列CD31相關(guān)聯(lián)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中。

目前有研究證據(jù)[12-13]表明CD31基因的單核苷酸多態(tài)性同冠心病等心血管系統(tǒng)疾病有密切的聯(lián)系，而其基因多態(tài)性及血清CD31含量同原發(fā)性肝癌之間的關(guān)系尚無相關(guān)報道，此次研究通過聚合酶鏈反應(yīng)及限制性片段長度態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，采用肝癌患者-健康對照者兩組對照的方式，對CD31基因Asn563Ser、Gly670Arg和Leu125Val的多態(tài)性進行研究分析。結(jié)果表明，原發(fā)性肝癌患者CD31基因Leu125Val位點基因型同健康人群相比具有顯著的差異(χ2=10.875，P<0.05)，通過分析等位基因頻率的相對風(fēng)險，可以發(fā)現(xiàn)，Val等位基因的攜帶者患肝癌的風(fēng)險為Leu等位基因的1.457倍(OR=1.457，95%CI：1.187～2.186)，表明Val等位基因有很大可能為肝癌的遺傳易感基因。而通過對CD31基因3個位點(Leu125Val、Arg670Gly和Ser563Asn)的單核苷酸多態(tài)性進行連鎖不平衡分析，結(jié)果表明這3個位點的單核苷酸多態(tài)性具有非常強烈的連鎖不平衡。結(jié)合對基因型的研究分析則表明，Val-Ser-Arg基因單倍型攜帶者與對照組相比，患肝癌的風(fēng)險顯著增高。上述研究結(jié)果表明，CD31基因Leu125Val多態(tài)性和Val-Ser-Arg基因單倍型在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中可能具有一定的相關(guān)性；而CD31基因Asn563Ser和Gly670Arg的多態(tài)性同肝癌的發(fā)生并無多大關(guān)聯(lián)。

在此次研究過程中，檢測了肝癌患者和健康對照者血清CD31的含量，結(jié)果表明肝癌組患者血清CD31含量顯著高于對照組，差異顯著。此外，有相關(guān)研究表明[14]，Val基因型攜帶者的肝癌患者體內(nèi)血清CD31含量顯著比不攜帶者要高，可以認(rèn)為CD31基因Leu125Val的單核苷酸多態(tài)性會對于血清含量的表達(dá)造成一定的影響。因而，在肝癌發(fā)生的早期，攜帶Val基因型的患者可能會由于CD31基因在體內(nèi)高度表達(dá)而增加罹患肝癌的可能性。

綜上所述，原發(fā)性肝癌是由遺傳、環(huán)境和生物等多種因素所造成的惡性腫瘤。通過此次研究表明，CD31基因的Leu125Val多態(tài)性及Val-Ser-Arg單倍型與原發(fā)性肝癌具有一定的關(guān)聯(lián)，其中Val等位基因有極大的可能是原發(fā)性肝癌的遺傳易感基因，攜帶Val基因型的患者可能會由于CD31基因在體內(nèi)高度表達(dá)而增加罹患肝癌的可能性。CD31基因單核苷酸多態(tài)性及血清水平與肝癌的相關(guān)研究才剛剛開始，期待能有更多的深入的研究報道，以期為預(yù)測肝癌的患病風(fēng)險、早期檢測和發(fā)現(xiàn)肝癌及其治療提供全新的方式。

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