董海影 張 春 韓翠翠 楊 瑩 馬立威 牛英才 劉吉成

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 151100)

目前，免疫治療成為了腫瘤治療的新方向。研究表明〔1〕，姬松茸多糖(LMPAB)既可直接作用于腫瘤細胞或誘導腫瘤細胞凋亡，也可通過增強宿主免疫力而發(fā)揮抗腫瘤作用。本課題組長期從事LMPAB抗腫瘤的研究，發(fā)現(xiàn)其可通過增強宿主的免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，如促進樹突細胞(DCs)成熟、激活巨噬細胞、活化T、B淋巴細胞、提高自然殺傷(NK)細胞、淋巴因子激活殺傷(LAK)細胞等細胞活性，證明其可能具有免疫佐劑的作用〔2〕。本研究主要探討低分子量LMPAB對 DCs Th1型免疫反應的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 LMPAB由齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究所分離提取，分子量約為48 000。卵白蛋白(OVA)和β-葡聚糖均由Sigma公司提供。

1.1.2動物 ICR雄性小鼠，6～8周齡，SPF 級，由吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心提供，許可證編號：SCXK (吉)2007-0003。

1.1.3試劑與儀器 白細胞介素-4(IL-4)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子(TNF)-α(RD公司)，WST(Millipore公司)，RPMI1640培養(yǎng)液與胎牛血清(Hyclone公司)。MR1812高速冷凍離心機為法國Jouan產品，MDF-492超低溫冰箱為日本三洋公司產品，AE-240型電子天平為梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1DCs的獲取 斷髓處死小鼠，75%酒精浸泡10 min，解剖取出小鼠股骨和脛骨，75%酒精浸泡3～5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)液沖洗骨髓至蒼白，200目篩網兩層過濾，離心去上清，加入紅細胞裂解緩沖液2 min，加入10 ml RPMI1640培養(yǎng)液離心去上清，加RPMI1640制成單細胞懸液，加入GM-CSF、IL-4和完全培養(yǎng)液CM 5 ml，在37℃ 5%CO2的條件下培養(yǎng)6～8 d，期間隔天半量換液，同時加入IL-4、GM-CSF。

1.2.2WST檢測細胞增殖 用RPMI1640完全培養(yǎng)液將DC制成單細胞懸液，將DC接種于96孔板，100 μl/孔、1×104個細胞/孔，然后分別加入LMPAB 5、10、20 μg/ml、OVA、β-葡聚糖+OVA和不含藥物培養(yǎng)液各100 μl，每孔四個平行孔，5%CO2、37℃下培養(yǎng)44 h，加入WST-1 10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測OD值。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IL-12與γ-干擾素(IFN-γ) 吸取DC的培養(yǎng)液上清，按照試劑盒要求檢測IL-12與IFN-γ水平。

2 結 果

2.1WST檢測DC對T淋巴細胞的增殖作用 見表1。

表1 WST檢測DC對T淋巴細胞的增殖作用

2.2ELISA方法檢測LMPAB對DC的Th1型免疫反應的影響 見表2。

表2 各組DC分泌IFN-γ與IL-12水平比較

3 討 論

臨床實踐證明，免疫治療抗腫瘤療效顯著，可有效遏制腫瘤的發(fā)展，延長患者的生命。同時研究發(fā)現(xiàn)，應用免疫佐劑可以提高腫瘤免疫治療的效果。癌癥患者因T細胞與NK 細胞功能不全，呈現(xiàn)腫瘤免疫抑制，進而妨礙腫瘤的免疫治療，影響其療效。免疫佐劑具有抗原載體功能，激活和增強抗原呈遞細胞(APC)的抗原遞呈功能，因此，免疫佐劑的應用將成為腫瘤免疫治療的新方向。而中草藥抗腫瘤作用具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應的特點，可作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，同時具有毒副作用低，能提高機體免疫力，不易產生耐藥性的優(yōu)勢，因此，天然植物中尋找抗腫瘤藥物是最重要的捷徑和手段。研究證明〔3〕，姬松茸的抗腫瘤作用療效顯著，是抗腫瘤大型蕈菌的代表菌屬，并且還具有用量少、作用明顯等特點，而其抗腫瘤的活性成分主要是多糖。前期研究表明〔4,5〕，LMPAB可以增強宿主免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，同時，LMPAB對DCs的成熟具有一定的影響〔6,7〕。DCs是體內最有效的專職抗原遞呈細胞，能夠激活初始型T細胞，并使其增殖，是啟動、調控并維持特異性免疫應答的中心環(huán)節(jié)〔8〕，是機體抵御惡性腫瘤的重要防御者。本次實驗結果表明，LMPAB 可以增強DCs對T淋巴細胞的增殖作用，可以增強DCs的生物學功能，IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素，主要由活化的T細胞和NK細胞產生，在機體細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著重要的作用〔9〕，成熟的DCs可分泌大量的IL-12、IFN-γ和TNF-α等細胞因子，而IFN-γ也可以促進DCs的成熟，進而增強DC的殺傷活性〔10〕，而IL-12分泌量取決于DCs的成熟狀態(tài)〔11〕，IL-12是Th1型免疫反應中最重要的細胞因子，促進Th1型免疫細胞的分化，啟動特異性T淋巴細胞反應并抑制Th2型免疫細胞的生成，在抗感染、抗腫瘤免疫反應中起舉足輕重的作用〔12〕，IL-12與IFN-γ兩者含量的增加可以增強DCs的生物學功能。本研究進一步闡明LMPAB的抗腫瘤機制，為臨床應用提供理論支持和幫助。

4 參考文獻

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