李 健 鐘美蓉 宋成軍 王小杰 陳志宏

(承德市中心醫(yī)院耳鼻喉科，河北 承德 067000)

糖尿病截肢患者幾乎都存在周?chē)窠?jīng)病變，病程20年的糖尿病患者，神經(jīng)病變的發(fā)病率約為60%，且隨病程延長(zhǎng)有逐漸增加的趨勢(shì)〔1〕。當(dāng)前，多以控制血糖并輔助營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)及活血化瘀等藥物治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變。在臨床上多用西藥控制血糖，但西藥的不良反應(yīng)不容忽視。前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠(彩色蠶繭水提取物)可明顯降低血糖和調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，保護(hù)糖尿病胰島細(xì)胞損傷和性腺功能障礙〔2～4〕。本研究觀(guān)察糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)微絲蛋白(NFP)表達(dá)的變化，探討絲膠對(duì)2型糖尿病周?chē)窠?jīng)損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)，美國(guó)Sigma公司；小鼠抗NFP多克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過(guò)濾、濃縮而成，彩色蠶繭由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 3月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，體重200～250 g(合格證號(hào)：712024)，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)選取12只為正常對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射同等劑量STZ溶劑(PH 4.4的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液)3次(1次/d)；其余的24只大鼠小劑量STZ連續(xù)腹腔注射(2% STZ，25 mg/kg，3 d)建立2型糖尿病動(dòng)物模型，7d后以空腹血糖≥16.7 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)〔5〕；然后再隨機(jī)分為糖尿病模型組和絲膠治療組，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d，正常對(duì)照組、模型組大鼠灌胃給予同等劑量的生理鹽水35 d。

1.3檢測(cè)血糖 各組大鼠用藥結(jié)束后4%水合氯醛腹腔注射麻醉，眶后靜脈叢采血，3 000 r/min離心20 min后取血清，應(yīng)用全自動(dòng)臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖。

1.4檢測(cè)坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá) 大鼠取血后斷頭處死，于膝關(guān)節(jié)上方取長(zhǎng)約4 cm的坐骨神經(jīng)干，入Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm。SP免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)。小鼠抗NFP一抗稀釋濃度1∶50，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，以坐骨神經(jīng)軸索中出現(xiàn)棕黃色顆粒為NFP陽(yáng)性反應(yīng)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析：每張切片于10×20倍顯微鏡下選取3個(gè)視野，計(jì)算免疫陽(yáng)性產(chǎn)物面積占視野面積的比值，每只大鼠選取6張切片，每組隨機(jī)選取6只大鼠，取平均值作為NFP的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠的血糖表達(dá) 糖尿病模型大鼠的血糖明顯高于正常對(duì)照組大鼠(P<0.01)；絲膠治療組大鼠的血糖明顯高于糖尿病模型大鼠(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠的血糖和坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)

2.2各組大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá) NFP免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色，位于坐骨神經(jīng)的軸索。與正常對(duì)照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；絲膠治療組大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)明顯高于糖尿病模型組大鼠(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)(免疫組化染色，×200)

3 討 論

糖尿病屬中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“消渴癥”范疇，糖尿病周?chē)窠?jīng)病變?cè)谔悄虿〉幕A(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，以臟腑陰虛燥熱、氣陰兩虛、津液疏布失常為基礎(chǔ)，隨著病程的延長(zhǎng)，日久導(dǎo)致癖血阻滯經(jīng)絡(luò)，出現(xiàn)肢體疼痛、麻木等諸多表現(xiàn)。蠶繭，蠶蛾科昆蟲(chóng)家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無(wú)毒，具有滋陰潤(rùn)燥、生精止渴作用，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消。

糖是機(jī)體重要的能量來(lái)源之一，正常穩(wěn)態(tài)的血糖可保證能量代謝的需要，血糖過(guò)高會(huì)引起一系列的病理生理變化。大量研究已經(jīng)證實(shí)，高血糖不但可導(dǎo)致糖尿病，還會(huì)降低機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性〔6〕。研究表明，長(zhǎng)期血糖控制不佳與糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的發(fā)生密切相關(guān)；而有效控制血糖，可以預(yù)防、延緩糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的發(fā)生與進(jìn)展〔1，7〕。

NFP是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的主要組成部分，是反應(yīng)神經(jīng)元和突觸功能狀況的內(nèi)在標(biāo)志物之一，在維持神經(jīng)細(xì)胞正常形態(tài)和軸漿運(yùn)輸方面具有至關(guān)重要的作用。細(xì)胞骨架是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的非膜性細(xì)胞器，由微管、微絲和中間絲等組成，神經(jīng)元中的中間絲主要為NFP。NFP除形成細(xì)胞骨架起支持作用外，還有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)98%有活性的多聚核糖體與NFP有關(guān)。以細(xì)胞松弛素D處理細(xì)胞，可使多聚核糖體脫落，同時(shí)蛋白質(zhì)合成停止，說(shuō)明NFP與DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)，并參與軸漿運(yùn)輸〔8〕。軸漿運(yùn)輸不僅為神經(jīng)元的新陳代謝提供物質(zhì)基礎(chǔ)，還參與神經(jīng)系統(tǒng)中的分子信息傳遞以及物質(zhì)交換，對(duì)神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)和功能的維持具有重要意義〔9〕。研究表明，糖尿病時(shí)存在明顯的骨架蛋白基因的改變〔10〕。Scott等〔10〕的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病時(shí)NFP的表達(dá)可下降26%～46%，并伴有有髓神經(jīng)纖維和無(wú)髓神經(jīng)纖維中NFP陽(yáng)性纖維及微管數(shù)量和密度的下降，以及無(wú)髓神經(jīng)纖維的萎縮。NFP表達(dá)的減少可導(dǎo)致神經(jīng)元的物質(zhì)合成、遷移和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程出現(xiàn)障礙，致使神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動(dòng)無(wú)法正常維持。

4 參考文獻(xiàn)

1Callaghan BC,Little AA,Feldman EL,etal.Enhanced glucose control for preventing and treating diabetic neuropathy 〔J〕.Cochrane Database Syst Rev,2012;6: CD007543.

2付秀美，鐘美蓉，陳志宏，等.絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011；31(1)：103-5.

3宋成軍，付文亮，陳志宏.絲膠預(yù)處理對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸生殖細(xì)胞的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011；31(13)：2459-61.

4付秀美，馬洪偉，陳志宏，等.絲膠對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用〔J〕.解剖學(xué)雜志，2010；33(2)：161-4.

5向雪松，王 竹，祝宇銘，等.鏈脲佐菌素注射劑量對(duì)建立2型糖尿病大鼠模型的影響〔J〕. 衛(wèi)生研究，2010；39(2)：138-42.

6Biarnes M,Montolio M,Nacher V,etal.Beta-cell death and mass in syngeneically transplanted islets exposed to short- and long-term hyperglycemia〔J〕.Diabetes,2002;51(1):66-72.

7Fujita Y,Fukushima M,Suzuki H,etal.Short-term intensive glycemic control improves vibratory sensation in type 2 diabetes 〔J〕.Diabetes Res Clin Pract,2008;80(1):e16-9.

8Ackerley S,James PA,Kalli A,etal.A mutation in the small heat-shock protein HSPB1 leading to distal hereditary motor neuronopathy disrupts neurofilament assembly and the axonal transport of specific cellular cargoes 〔J〕.Hum Mol Genet,2006;15(2):347-54.

9Zochodne DW,Sun HS,Cheng C,etal.Accelerated diabetic neuropathy in axons without neurofilaments 〔J〕.Brain,2004;127(Pt 10):2193-200.

10Scott JN,Clark AW,Zochodne DW.Neurofilament and tubulin gene expression in progressive experimental diabetes: failure of synthesis and export by sensory neurons〔J〕.Brain,1999;122(Pt11) :2109-18.