李建華 周麗芬 劉筱藹 陳志勇 趙珅婷 彭妙茹 扶招弟

(廣州醫(yī)科大學生理學教研室，廣東 廣州 510182)

有證據表明哮喘發(fā)病率逐年增加〔1〕。哮喘的發(fā)病機制相當復雜，目前國際醫(yī)學界普遍認為哮喘是由多種細胞、細胞因子和炎癥介質引起的以氣道高反應性為特征的慢性炎癥性疾病。經典瞬時受體電位(TRPC)是一種可以介導胞外Ca2+內流的通道，包括TRPC 1～7共7個成員。TRPC6是胞內鈣信號產生的一個重要途徑〔2〕，因被發(fā)現在肺部多種細胞中高表達而成為治療哮喘和慢性阻塞性肺病的潛在的新藥物靶點〔3〕。本研究擬通過建立小鼠哮喘模型，研究哮喘小鼠肺組織中TRPC6與核轉錄因子(NF)-κB、細胞黏附因子(ICAM)-1的表達及定位，及其與哮喘氣道炎癥的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物和試劑 Balb/c雌性健康小鼠14只(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，6～8周齡，體重15～17 g。卵白蛋白(OVA，Sigma公司)；一抗分別為兔抗小鼠TRPC6多克隆抗體(Abcam 公司)、兔抗小鼠NF-κB P65抗體(Abcam公司)、兔抗小鼠ICAM-1抗體(Santa Cruz公司)，二抗辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG(北京鼎國，進口分裝)，濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠哮喘模型的建立 實驗分為正常組和哮喘組，每組7只。將小鼠放入大小鼠隔離器中飼養(yǎng)，適應環(huán)境1 w。致敏期：適應環(huán)境后的第1天和第12天，哮喘組小鼠每只腹腔注射0.2 ml的OVA致敏液，正常組注射等體積的生理鹽水。激發(fā)急性期：于第18～23天給予哮喘組小鼠霧化吸入5%的OVA溶液，1次/d，30 min/次，正常組給予等量生理鹽水霧化。慢性期：第26～55天以5%的OVA溶液霧化激發(fā)哮喘組小鼠，3次/w，30 min/次，正常組小鼠等量生理鹽水霧化。末次霧化激發(fā)48 h后，使用美國BUXCO無創(chuàng)小動物肺功能儀檢測Balb/c小鼠的氣道反應性。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液(BALF)的細胞計數 測定氣道反應性后，每只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.1 ml/10 g，使其麻醉。仰臥位固定小鼠，進行氣管插管，解剖分離出左肺后結扎左支氣管，每次以0.4 ml 磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗右肺，反復灌洗回收3次。收集的BALF，于4 ℃ 1 500 r/min離心10 min。沉淀細胞用1 ml PBS重懸，吹打均勻后取10 μl于血細胞計數板上進行白細胞(WBC)總數計數。余下的BALF 4 ℃ 1 500 r/min離心10 min，棄上清，取細胞沉淀作涂片，4%多聚甲醛固定后HE染色，光學顯微鏡下進行細胞學分類計數，求出嗜酸粒細胞占細胞總數百分比(EOS%)。

1.2.3免疫組織化學法觀察TRPC6、NF-κB 、ICAM-1蛋白的表達 將灌洗后的右肺分離，置于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水后常規(guī)石蠟包埋。取石蠟切片，常規(guī)脫蠟，脫水，抗原修復10 min，3%H2O2(80%甲醇配制)室溫避光孵育10 min；PBS沖洗3 min×3次，山羊血清37℃封閉20 min；滴加稀釋一抗：TRPC6(1∶300)、NF-κB(1∶500)、ICAM-1(1∶300)，37℃孵育1 h；PBS沖洗3 min×3次，滴加1∶600稀釋的二抗，37℃孵育1 h；PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗，終止顯色。蘇木精復染，自來水沖洗，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察，陽性表達部位為組織出現棕黃色顆粒改變。同一光強度下，顯微鏡(×200)隨機選取5個視野拍照保存，應用Image-pro Plus(IPP)6.0圖像分析系統(tǒng)檢測累積光密度值(IOD)，計算TRPC6、NF-κB 、ICAM-1蛋白相對表達量。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，均數采用成組設計的t檢驗、相關性分析采用Pearson 直線相關法。

2 結 果

2.1動物激發(fā)后的表現 哮喘組小鼠霧化吸入5～10 min開始出現煩躁不安、噴嚏、呼吸急促、口唇紫紺和腹部痙攣伴腹式呼吸；正常組小鼠霧化吸入時活動自如，未出現煩躁不安、豎毛和呼吸急促等陽性反應。BUXCO無創(chuàng)小動物肺功能儀測試后發(fā)現，哮喘組小鼠的氣道反應性明顯高于正常組。由此可見，哮喘動物模型成功建立。

2.2支氣管肺泡灌洗液的細胞計數 經4%多聚甲醛固定，HE染色后進行細胞計數，哮喘組小鼠BALF中的WBC總數(×104/ml)和EOS%分別為(118.14±2.33)和(42.57±1.13)，而正常組的WBC總數(×104/ml)和EOS%分別為(25.64±0.62)和(0.86±0.07)。兩組相比，哮喘組的WBC總數和EOS%均明顯增高(P<0.01)。

2.3TRPC6蛋白在肺組織的表達與定位 免疫組化結果顯示，正常小鼠肺組織中支氣管上皮細胞有少量陽性表達，其他部位表達不明顯，而哮喘小鼠肺組織中支氣管上皮細胞、浸潤的炎癥細胞、血管內皮細胞、肺泡上皮細胞表達均明顯增強(P<0.01)(表1，圖1)。

2.4NF-κB蛋白在肺組織的表達與定位 NF-κB 亞基P65免疫組化結果顯示，正常組支氣管上皮細胞僅有少量P65表達，而哮喘組支氣管上皮細胞、浸潤的炎癥細胞、血管內皮細胞、肺泡上皮細胞的表達均較正常組有明顯增強(P<0.01)(表1，圖2)。

2.5ICAM-1蛋白在肺組織的表達與定位 ICAM-1蛋白免疫組化結果顯示，正常小鼠肺組織中支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞表達較弱，哮喘小鼠肺組織中除上述細胞外還有浸潤的炎癥細胞表達均增強(P<0.01)(表1，圖3)。

2.6相關性分析 結果顯示，小鼠肺組織中TRPC6蛋白表達與NF-κB、ICAM-1蛋白呈顯著性正相關(r分別為0.72和0.62，P<0.05)；TRPC6蛋白表達也與BALF液中的WBC總數、EOS%呈顯著性正相關(r分別為0.82和0.84，P<0.01)。

圖1 小鼠肺組織TRPC6免疫組化染色圖(×200)

圖2 小鼠肺組織NF-κB P65免疫組化染色圖(×200)

圖3 小鼠肺組織ICAM-1免疫組化染色圖(×200)

表1 兩組小鼠肺組織TRPC6、NF-κB、ICAM-1蛋白表達情況

3 討 論

ICAM-1在結構上屬于免疫球蛋白超家族，其可介導炎癥細胞黏附至血管內皮細胞、上皮細胞調節(jié)炎癥反應，還可介導T細胞與T細胞、T細胞與靶細胞、T細胞與B細胞的相互作用參與免疫應答反應，因此成為許多炎癥性疾病(如哮喘)發(fā)病機制的研究熱點。ICAM-l在靜止的白細胞、內皮細胞呈低水平表達，但在干擾素-γ、白介素-1β和腫瘤壞死因子-α等一些因素的刺激下，ICAM-1在上皮細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等上表達增加。這些細胞上調表達ICAM-l可以受到許多環(huán)節(jié)的調控，目前研究較多的是基因水平轉錄的調控。NF-κB是一種多功能核轉錄因子，能促進細胞因子、黏附分子、趨化因子等的轉錄，在機體的免疫應答、炎癥反應和細胞的生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用〔4〕。NF-κB 是由P50 和P65組成的異源二聚體，通常情況下，抑制因子IκB同NF-κB二聚體相結合，使其以失活狀態(tài)存在于胞質中。在外源刺激作用下，發(fā)生IκB的泛素化及蛋白酶途徑的降解，引起NF-κB-IκB復合物的解體，從而使NF-κB活化并借助核定位信號進入細胞核發(fā)揮轉錄調節(jié)的作用。文獻報道〔5，6〕，凝血酶誘導的NF-κB亞基P65的活化可調控ICAM-1，其與ICAM-1基因的κB位點結合從而促進ICAM-1的表達。Hart等〔7〕利用EMSA和免疫組化技術首次在輕度哮喘病人的誘導痰和支氣管活檢標本中發(fā)現NF-κB的活化較正常組增加，NF-κB表達的部位主要是氣道上皮細胞和炎癥細胞。Furusho等〔8〕發(fā)現，與野生型小鼠相比較，ICAM-1基因敲除小鼠中的炎癥細胞數目、氣道高反應性、支氣管肺泡灌洗液中的細胞因子等均減輕。以上研究提示，氣道炎癥可能與NF-κB介導的ICAM-1有關。

NF-κB、ICAM-1的表達具鈣依賴性〔9，10〕，Ca2+濃度的升高機制比較復雜，可能與Ca2+內流有關。有文獻報道〔11〕TRPC通道是Ca2+內流主要途徑。凝血酶能誘導細胞內鈣濃度的增加，Bair等〔12，13〕用TRPC通道阻斷劑2-APB能抑制凝血酶誘導人肺動脈內皮細胞中的鈣濃度增加、NF-κB的活化以及ICAM-1 mRNA的表達，離體培養(yǎng)的TRPC4基因敲除小鼠肺內皮細胞ICAM-1 mRNA較野生型表達下降，Bair等〔12〕的研究提示NF-κB依賴性的ICAM-1與TRPC4有一定的聯系，但與TRPC6之間的關系目前未見報道。Finney-Hayward等〔14〕發(fā)現正常人肺泡和肺組織巨噬細胞表達TRPC6 mRNA和蛋白，進一步的研究發(fā)現慢性阻塞性肺病的病人肺泡巨噬細胞TRPC6 mRNA比正常組顯著增高但TRPC3和TRPC7 mRNA的表達卻無差異，提示TRPC6可能與肺組織巨噬細胞活化有關；Sel等〔15〕用OVA急性致敏/激發(fā)TRPC6基因敲除小鼠，發(fā)現支氣管肺泡灌洗液中IL-5、IL-13含量降低，氣道嗜酸性細胞浸潤和血IgE水平明顯減少，提示TRPC6可能與哮喘的發(fā)病機制有關。本研究提示，TRPC6可能通過NF-κB和ICAM-1使炎癥細胞浸潤，參與哮喘的發(fā)病機制。因此，探究TRPC6與NF-κB、ICAM-1之間的關系將為哮喘發(fā)病機制研究開辟新的途徑。

4 參考文獻

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