宋曉斌 李晨玉 楊 威 方曉白 劉銅軍 景遐斌

(吉林省人民醫(yī)院急診外科，吉林 長春 130021)

表阿霉素(EPI)是目前肝癌治療的一線用藥，但傳統(tǒng)的小分子化療藥缺乏腫瘤特異性，會(huì)同時(shí)殺傷正常組織細(xì)胞。納米靶向控釋系統(tǒng)與藥物的結(jié)合可以提高藥效和降低藥物副作用，本文以EPI為前體藥物，選擇具有腫瘤靶向呈遞作用的聚乙二醇-b-聚乳酸-co-碳酸酯聚合物〔PEG-b-P(LA-co-DHP)〕為載體材料，制備具有靶向控釋作用的鍵合EPI納米膠束(EPI-NPs)，通過肝動(dòng)脈灌注給藥應(yīng)用于大鼠移植性肝癌模型，利用EPI具有自發(fā)熒光的特點(diǎn)研究EPI-NPs在大鼠體內(nèi)臟器的分布，探討EPI-NPs的靶向控釋機(jī)制及抑瘤效果。

1 材料與方法

1.1材料 EPI原藥純度約98%，購自浙江海正制藥有限公司?？瞻啄z束及EPI-NPs由中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所制備。EPI-NPs平均粒徑為86 nm，EPI的質(zhì)量含量為14.7%。Walker-256瘤株購自北京醫(yī)科院腫瘤研究所。Wistar幼鼠(120～140 g)、Wistar大鼠(180～220 g)由吉林大學(xué)動(dòng)物研究中心提供，均為雄性。

1.2Walker-256細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代 復(fù)蘇Walker-256瘤株，體外培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)2×106ml-1。取1 ml細(xì)胞懸液注入幼鼠腹腔，制作傳代鼠。7 d后從傳代鼠腹腔內(nèi)抽取癌性腹水觀察，見腹水呈乳白色或淡血性。將腹水原液離心、洗滌、再次離心，棄上清液保留下層的半液態(tài)物，以生理鹽水調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.5×107個(gè)/ml，注入幼鼠腹腔繼續(xù)傳代或試驗(yàn)用。按上述方法每7 d傳代1次。

1.3直接注射法制作大鼠轉(zhuǎn)移性肝癌模型 麻醉、固定樣本大鼠，小切口開腹后均選取肝左葉種植腫瘤。用1 ml注射器抽取前述瘤細(xì)胞懸液，斜行進(jìn)針刺入肝被膜，然后進(jìn)針方向改為水平并做迷路穿刺，將腫瘤細(xì)胞0.05 ml注入肝被膜下。拔針后按壓穿刺點(diǎn)止血并關(guān)腹。

1.4肝動(dòng)脈灌注給藥 于種瘤后8 d，麻醉模型鼠，再次開腹后顯露肝臟及腫瘤，游標(biāo)卡尺測定腫瘤長短徑。手術(shù)顯微鏡下分離肝動(dòng)脈，用1 ml胰島素注射器行肝動(dòng)脈穿刺并緩慢注藥。注藥結(jié)束后立即以無菌棉簽按壓動(dòng)脈穿刺口止血。

1.5藥物體內(nèi)分布觀察 將模型鼠(n=84只)隨機(jī)分為EPI組和EPI-NPs組，均按EPI含量2 mg/kg給藥。設(shè)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組大鼠于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均隨機(jī)選取6只處死，進(jìn)行勻漿熒光檢測。從肝臟剝離腫瘤并稱重；摘取模型鼠體內(nèi)臟器(肝、脾、肺、腎、心、腦)，于每個(gè)臟器不同部位隨機(jī)剪取6塊組織并稱重。將上述組織按照20 ml/g的比例添加雙蒸水，使用組織勻漿機(jī)(T10 basic ULTRA-TURRAX)分別勻漿。取勻漿液200 μl加至96孔板，使用酶標(biāo)儀對熒光強(qiáng)度做定量分析。

1.6藥效觀察 (1)抑瘤率：①動(dòng)物分組：在肝臟移植腫瘤8 d后，將腫瘤直徑約1.0 cm的模型鼠(CT掃描證實(shí)，n=30)隨機(jī)分為生理鹽水組、EPI組和EPI-NPs組(n=10)。給藥前先用游標(biāo)卡尺測量瘤徑，計(jì)算治療前腫瘤體積；按前述劑量、方法給藥。②藥效觀察：給藥1 w后處死大鼠，從肝臟完整剝離腫瘤，測量瘤徑并稱重，計(jì)算治療后腫瘤體積及瘤重。按下面公式計(jì)算體積抑瘤率和質(zhì)量抑瘤率(△V=治療后體積-治療前體積)。體積抑瘤率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組△V/生理鹽水組△V)×100%；質(zhì)量抑瘤率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/生理鹽水組平均瘤重)×100%。(2)生存分析：動(dòng)物分組及給藥方式同上。自然飼養(yǎng)，術(shù)后常規(guī)肌注青霉素預(yù)防感染，觀察大鼠存活時(shí)間并做生存分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Student-t檢驗(yàn)和Kaplan-Meier生存分析。

2 結(jié) 果

2.1勻漿熒光定量檢測EPI和EPI-NPs在大鼠體內(nèi)分布 除腦組織外，EPI熒光在模型鼠其他臟器組織的分布及變化趨勢基本一致，在EPI進(jìn)入體內(nèi)后有個(gè)“減弱-增強(qiáng)-再減弱-消失”的過程，在給藥2 h后再次形成分布高峰，但低于起始熒光強(qiáng)度。在腦組織，起始熒光強(qiáng)度較低，而后逐漸增強(qiáng)并在2 h亦出現(xiàn)分布高峰，此時(shí)其熒光強(qiáng)度同其他組織比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。EPI-NPs組各組織中藥物熒光強(qiáng)度表現(xiàn)為腫瘤>肝>脾、肺、腎>心>腦，除腦外的其他臟器組織藥物熒光變化趨勢基本一致，分別在15 min、2 h形成2個(gè)分布高峰，第2峰高于第1峰。8 h時(shí)，在除了心和腦外的其他組織仍保持了一定程度的熒光富集。腦組織在所有時(shí)間點(diǎn)上檢測不到熒光。見圖1。

圖1 EPI和EPI-NPs組藥物熒光在模型鼠體內(nèi)的分布

2.2藥物的抑瘤效果檢測 各組大鼠給藥后1 w，體積抑瘤率及質(zhì)量抑瘤率分析均提示EPI-NPs組的抑瘤效果明顯高于EPI組(P<0.05)，而EPI組的抑瘤效果明顯高于生理鹽水組(P<0.05)，即EPI-NPs組>EPI組>NS組，見表1。

表1 各組體積抑制率和質(zhì)量抑制率比較

2.3生存分析 生理鹽水組、EPI組、EPI-NPs組大鼠的中位生存時(shí)間分別為(16±0.93)、(27.2±2.25)、(43.3±3.98)d，3組差異顯著(P<0.01)，并且EPI-NPs組有2只大鼠60 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍然存活，表明EPI和EPI-NPs對腫瘤治療有效，可以延長荷瘤大鼠存活時(shí)間， EPI-NPs效果更為顯著。見圖2。

圖2 NS組、EPI組和EPI-NPs組生存率的比較

3 討 論

傳統(tǒng)的EPI小分子藥在體內(nèi)是平均分布的，為了使該藥能夠在靶器官和靶組織達(dá)到有效的藥物濃度，提高藥物療效并降低其全身副作用，將EPI通過酸降解的腙鍵與納米載體鍵合形成EPI-NPs，使其具有良好的pH靶向性和被動(dòng)靶向功能〔1〕，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)EPI在靶器官和靶組織的重分布。

通過肝動(dòng)脈灌注直接給藥，富含藥物的肝動(dòng)脈血基本上提供了腫瘤組織的全部血供〔2，3〕，而EPI-NPs平均粒徑為86 nm，“增強(qiáng)的通透性和滯留效應(yīng)”(EPR效應(yīng))使高分子鍵合藥在腫瘤局部發(fā)生滯留〔4～6〕，所以腫瘤組織的EPI熒光強(qiáng)度高于體內(nèi)其他臟器，體現(xiàn)了鍵合藥良好的組織靶向性。肝臟亦有大量藥物熒光富集，這是納米藥物“肝臟被動(dòng)靶向機(jī)制”的具體體現(xiàn)〔7，8〕，說明鍵合藥具有良好的器官靶向性。肝內(nèi)含有豐富的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)，大量吞噬EPI-NPs后成為了藥物“貯庫”。在吞噬細(xì)胞內(nèi)酸性的環(huán)境中，鍵合藥良好的pH靶向性(載體連接藥物的腙鍵為酸降解性)使小分子EPI從鍵合載體上游離出來并持續(xù)釋放入肝血竇，這樣就在一定程度上控制了藥物在靶器官內(nèi)的緩慢釋放。載藥納米粒首先要經(jīng)過肝而被肝內(nèi)RES大量吞噬，然后再隨血液循環(huán)陸續(xù)通過同樣富含RES的肺、脾、腎，且首過效應(yīng)亦使部分EPI在肝內(nèi)被代謝和滅活，從而使藥物在上述臟器分布有所降低。在腦組織中未測到藥物熒光，這同血腦屏障的存在有關(guān)：正常血液的pH值是7.4，酸降解的鍵合大分子藥在血液循環(huán)過程中很難釋放出可以通過血腦屏障的EPI小分子藥，這就形成了腦組織中基本無藥物分布的狀態(tài)〔9〕。

除了腦組織外，各臟器藥物熒光在15 min和2 h形成了兩個(gè)分布高峰，出現(xiàn)“雙峰現(xiàn)象”。分析這是由肝臟的雙峰現(xiàn)象引起〔10〕：15 min時(shí)的“第一峰”同鍵合藥在腫瘤組織的滯留有關(guān)，即因?yàn)镋PR效應(yīng)，納米藥物離開靶組織的速度要低于進(jìn)入速度，藥物在腫瘤組織中出現(xiàn)了蓄積。而2 h形成的“第二峰”則考慮同藥物的“肝腸循環(huán)”有關(guān)。肝內(nèi)藥物濃度升高引起循環(huán)血藥濃度增加，繼而使肺、心、脾、腎的藥物分布的增加?！半p峰現(xiàn)象”不僅延長了藥物在靶器官的作用時(shí)間，而且增加了靶器官內(nèi)藥物的分布比例，這對于肝臟腫瘤的化療無疑是有利的。本文結(jié)果證明EPI-NPs可以通過其靶向和控釋機(jī)制，將EPI靶向釋放于肝組織特別是肝內(nèi)的腫瘤組織，降低了EPI的全身及肝臟局部的毒副作用，使大鼠存活時(shí)間得以延長。

綜上，具有被動(dòng)靶向和pH靶向的雙重靶向特點(diǎn)EPI-NPs可以較精確地靶向于肝組織和腫瘤組織，不僅保證了對腫瘤細(xì)胞足夠的細(xì)胞毒性，也降低了EPI的全身毒副作用，提高了EPI的生物利用度。

4 參考文獻(xiàn)

1宋曉斌，劉銅軍，胡秀麗，等.鍵合表柔比星納米膠束對Walker-256細(xì)胞株的增殖抑制作用〔J〕.中國老年醫(yī)學(xué)雜志,2011；31(5):843-6.

2Caperuto EA，Tomatieli RV，Colquhoun A,etal.β-Hydroxy-β-methylbutyrate supplementation affects Walker 256 tumor-bearing rats in a time-dependent manner〔J〕.Clin Nut，2007；26:117-22.

3Liu X，Heng WS，Paul A,etal.Novel polymeric microspheres containing norcantharidin for chemoembolization〔J〕.J Control Release，2006；116(1):35-41.

4李 堅(jiān)，張陽德，趙勁風(fēng)，等.表阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯磁性納米粒靶向治療裸鼠移植性肝癌〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011；28(7):1111-4.

5Maeda H，Wu J，Sawa T,etal.Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics：a review〔J〕.J Control Release，2000；65:271-84.

6Arias JL.Drug targeting strategies in cancer treatment：an overview〔J〕. Mini Rev Med Chem，2011；11(1):1-17.

7Jin C，Qian N，Zhao W,etal.Improved therapeutic effect of DOX-PLGA-PEG micelles decorated with bivalent fragment HAb18 F(ab') for hepatocellular carcinoma〔J〕.Biomacromolecules，2010；11:2422-31.

8Yuan L，Wang J，Shen WC.Reversible lipidization of somatostatin analogues for the liver targeting〔J〕.Eur J Pharm Biopharm，2008；70:615-20.

9宋曉斌.鍵合表阿霉素納米膠束肝動(dòng)脈灌注靶向治療大鼠移植性肝癌的實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.長春：吉林大學(xué)博士學(xué)位論文，2011：100-2.

10李晨玉，宋曉斌，楊 威，等.表阿霉素納米膠束靶向治療大鼠移植性肝癌〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013；30(10):2052-5.