孫鳳娟 劉亞平

(濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌二科，山東 濟(jì)寧 271000)

近年來(lái)，氧化應(yīng)激在糖尿病腎病(DN)發(fā)病機(jī)制中作用引起人們的廣泛關(guān)注〔1〕，而高糖介導(dǎo)的腎小球和腎小管細(xì)胞凋亡是引起腎功能惡化的一個(gè)重要原因〔2〕，有研究指出，高糖高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠造模成功后喂養(yǎng)6～8 w，腎臟已出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變〔3〕，本研究探討硫辛酸(LA)對(duì)DN大鼠的血清晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)及氧化應(yīng)激的影響，并觀察腎臟AGE(RAGE)的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1材料 3月齡健康雌性Wistar大鼠30只〔山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)：SCXR(魯)20030004〕，平均體重(276.36±7.79)g。普通飼料和高糖高脂飼料(普通飼料中添加10%豬油、10%蛋黃粉和20%蔗糖)〔4〕均由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。STZ購(gòu)自Sigma公司，用前以0.1 mmol/L，pH4.2的檸檬酸鹽緩沖液溶解，新鮮配成2%STZ溶液，經(jīng)濾菌器除菌。

1.2方法

1.2.1造模 實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，按體重編號(hào)，隨機(jī)取6只作正常組，喂以普通飼料。余24只大鼠作糖尿病造模組，高糖高脂飼料喂養(yǎng)8 w(不限每日熱量)，禁食12 h后左下腹腔注射STZ(30 mg/kg，隔2 w 1次，共2次)，正常對(duì)照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。末次STZ注射1 w后糖尿病造模組尾靜脈行腹腔內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)〔5〕。以空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L，或糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L者為糖尿病造模成功鼠〔6〕。繼續(xù)喂養(yǎng)8 w，糖尿病大鼠以隨機(jī)血糖≥16.0 mmol/L伴胰島素敏感性下降，并出現(xiàn)微量白蛋白尿?yàn)樘悄虿∧I病造模成功鼠〔3〕，剔出因感染死亡和造模未成功的大鼠，入選DN造模成功鼠為16只，按血糖水平隨機(jī)分為DN組和LA組，每組8只，分別給予生理鹽水和LA(50 mg·kg-1·d-1)1 ml腹腔注射4 w，每周按體重調(diào)整各組注射劑量。

1.2.2觀察指標(biāo) 成模后所有大鼠每周固定時(shí)間測(cè)隨機(jī)血糖和體重，共觀察4 w。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，三組大鼠留取24 h尿，檢測(cè)尿蛋白，次日空腹8 h后頸動(dòng)脈穿刺取血處死。分離血清以檢測(cè)FPG、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白酶固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(比色法，全自動(dòng)生化分析儀)；血清胰島素(FINS)(試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物有限公司，批內(nèi)變異系數(shù)<10%，批間變異系數(shù)<15%，由我院核醫(yī)學(xué)科測(cè)定)、丙二醛(MDA)、硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)(試劑盒均購(gòu)自南京建成)；抗凝血糖化血紅蛋白(GHbA1c)(比色法，試劑盒購(gòu)自南京建成)；用熒光分光光度計(jì)在340 nm波長(zhǎng)激發(fā)光和456 nm發(fā)射光下，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定稀釋液的蛋白質(zhì)濃度，以此血清AGEs含量間接反映腎組織AGEs含量。提取三組大鼠腎臟總RNA，利用RT-PCR方法檢測(cè)大鼠腎臟RAGE基因表達(dá)。計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(IAI)=In(1/FINS×FPG)，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5〔2〕。

1.2.3儀器設(shè)備 RF5301PC型紫外熒光分光光度計(jì)(日本島津)、MDF-382E型Ultra-low Temperature Freezer(日本SANYO電子化學(xué)有限公司)、ZDX-35型自動(dòng)不銹鋼座式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、DYY-12型電泳槽(北京六一儀器廠)、Alpha MutiImage Light Cabinet Filter Positions凝膠成像系統(tǒng)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠體重、隨機(jī)血糖的變化 與普通飼料喂養(yǎng)的正常組大鼠比較，造模組大鼠高脂飲食8 w后體重明顯增加(P<0.01)，增重8.8%，此后DN組及LA組體重有所下降，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，DN組大鼠體重顯著高于正常組，LA組與正常組無(wú)顯著性差異；單純高脂飲食8 w，兩組大鼠血糖沒(méi)有顯著性差異，注射兩次STZ 1 w后DN造模組大鼠血糖明顯升高并且高血糖癥持續(xù)存在，隨機(jī)血糖平均(16.82±7.68)mmol/L，LA組隨機(jī)血糖平均(13.36±5.72)mmol/L。

2.2三組大鼠血AGEs、胰島素及胰島素抵抗(IR)等的變化 與正常組比較，DN組和LA組大鼠血AGEs、GHbA1c、FPG、FINS及HOMA-IR均升高，IAI下降(P<0.01),說(shuō)明存在IR；與DN組大鼠比較，LA組大鼠血AGEs、GHbA1c、FPG、FINS及HOMA-IR下降(P<0.05)，IAI上升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3三組大鼠血脂、24 h尿蛋白水平的變化 與正常組比較，DN組大鼠血TC、TG、LDL-C、24 h尿蛋白均升高(P均<0.05)，說(shuō)明存在脂代謝、腎功能紊亂；與DN組大鼠比較，LA組大鼠血TC、TG、LDL-C、24 h尿蛋白下降(P<0.05)；三組大鼠HDL-C無(wú)明顯變化。見(jiàn)表2。

表1 三組大鼠血AGEs、GHbA1c、FPG、FINS、IAI、HOMA-IR的比較

表2 三組大鼠血脂的比較

2.4三組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化 與正常組比較，DN組大鼠血MDA、SOD均升高(P<0.05),與DN組比較，LA組血MDA、SOD均下降，血GSH-Px增加，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.5三組大鼠RAGE的RT-PCR結(jié)果 腎組織總RNA OD260/OD280均介于1.7～2.0之間，說(shuō)明總RNA純度較高，基本沒(méi)有蛋白質(zhì)污染。甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳示28S與18S的光密度比值約為2，說(shuō)明總RNA的完整性較好，基本無(wú)降解。LA組和DN組均檢測(cè)到腎臟組織RAGE的表達(dá)，正常對(duì)照組未檢測(cè)到RAGE表達(dá)。見(jiàn)圖1。

表3 三組大鼠血MDA、GSH-Px、SOD的比較

圖1 三組大鼠腎臟RAGE基因的PT-PCR

3 討 論

肥胖患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，容易誘發(fā)多種慢性疾病，如腫瘤、糖尿病、心腦血管疾病等〔7〕，使用有效的抗氧化劑對(duì)降低上述慢性疾病的發(fā)生具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)對(duì)以往的研究方法〔3，5〕，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合腹腔兩次小劑量STZ注射的方法誘導(dǎo)建立雌性大鼠糖尿病模型，結(jié)果該模型大鼠的血糖、GHbA1c升高，空腹FINS、HOMA-IR升高，高糖高脂喂養(yǎng)8 w后體重增重8.8%，并具有脂代謝紊亂的特點(diǎn)，比較接近人類2型糖尿病的發(fā)病特征，繼續(xù)喂養(yǎng)8 w造模組大鼠24 h尿蛋白顯著升高，是研究人類2型DN較理想的動(dòng)物模型。LA干預(yù)后，上述指標(biāo)均有顯著性下降，提示其可以針對(duì)自由基對(duì)胰島細(xì)胞、血管內(nèi)皮的攻擊產(chǎn)生保護(hù)作用〔8〕。本實(shí)驗(yàn)糖尿病組大鼠SOD升高，可能是機(jī)體采取的適應(yīng)性反應(yīng)〔9〕。

糖尿病時(shí)，葡萄糖等還原糖可與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸在非酶糖化條件下形成AGEs并在體內(nèi)沉積；炎癥、腎功能不全和神經(jīng)衰退性疾病時(shí)，氧化應(yīng)激增加也可產(chǎn)生大量的AGEs〔10〕，程序性死亡配體(PDL)1與其受體PD1途徑傳遞抑制信號(hào)，減弱免疫應(yīng)答，抑制細(xì)胞增殖及釋放細(xì)胞因子，杜宣等〔11〕發(fā)現(xiàn)AGEs作用下的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)表面PDL1分子呈上調(diào)性表達(dá)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源性AGEs可誘導(dǎo)HUVEC過(guò)量表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白1、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)1、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)1等促炎因子〔12〕,而LA能逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象，可以推測(cè)LA減輕糖尿病患者血管炎癥部位的內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)。在糖尿病人或動(dòng)物模型時(shí)，視網(wǎng)膜、系膜細(xì)胞和主動(dòng)脈上均有伴AGEs沉積的高水平的RAGE表達(dá)。AGEs-RAGE結(jié)合后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，生成大量氧自由基，從而激活對(duì)氧自由基敏感的轉(zhuǎn)錄因子核因子(NF)-κB，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1、腫瘤狀死因子(TNF)-α和黏附分子的產(chǎn)生,導(dǎo)致腎小球、腎小管細(xì)胞的分化、生成和作用受損。本實(shí)驗(yàn)提示LA可能通過(guò)干預(yù)上述通路發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

DN的發(fā)病機(jī)制中存在氧化應(yīng)激〔1，13〕，體外試驗(yàn)證實(shí)高糖本身直接加劇體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激〔14，15〕。飲食中加入抗氧化劑能預(yù)防和減輕糖尿病慢性并發(fā)癥，Craven等〔16，17〕指出維生素E、維生素C、α-LA等能減輕糖尿病腎損害，每天大劑量維生素E攝入(1 600～1 800 IU/d)或者短期(3個(gè)月)口服LA(300～600 mg/d)能減輕1型和2型臨床糖尿病腎病患者的尿蛋白，并且減輕1型糖尿病患者早期腎臟高濾過(guò)〔18〕，與此同時(shí)Melhem等〔17〕發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠每天攝入維生素C(1 g/kg)、維生素E(100 IU/kg)2個(gè)月，并沒(méi)有持續(xù)抑制尿白蛋白排泄率、腎小球體積、腎小球或腎小管TGF-β含量、腎小球Ⅳ型膠原α1含量，相反，每天給予LA(30 mg/kg)組糖尿病大鼠，上述指標(biāo)及MDA顯著性下降，提示LA通過(guò)氧化應(yīng)激參與有效的腎臟保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)與前述研究結(jié)果相符。

本實(shí)驗(yàn)LA干預(yù)后血AGEs含量減少，腎組織中檢測(cè)出RAGE表達(dá)，支持李雪竹等〔19〕的研究，其實(shí)驗(yàn)指出LA治療組24 h尿蛋白定量減少，腎小球系膜擴(kuò)張、基質(zhì)增生、腎小管上皮空泡變性等病理改變減輕，MDA和尿中DNA氧化損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)水平下降，過(guò)氧化物酶(CAT)和GSH增加，血AGEs含量減少，RAGE表達(dá)下調(diào)，提示DN時(shí)循環(huán)和腎組織局部AGEs含量增高，RAGE表達(dá)上調(diào)，LA可通過(guò)減少氧化應(yīng)激而抑制AGEs生成及下調(diào)RAGE表達(dá)，進(jìn)而改善DN大鼠腎組織結(jié)構(gòu)和腎功能，在防治DN方面有良好的應(yīng)用前景。

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