秦莉花 李 晟 陳曉陽 秦莉峰 方 晗 吳艷飛 黃 寬

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208)

抑郁癥(DEP)以顯著持續(xù)性心境低落為主要特征，同時也存在認知功能改變和其他精神癥狀、食欲、睡眠障礙以及自主神經(jīng)功能紊亂、特發(fā)性疼痛等伴發(fā)癥狀。世界衛(wèi)生組織研究顯示，在全球神經(jīng)精神疾病的負擔(dān)中，預(yù)測到2020年DEP將成為僅次于冠心病的第2位疾病負擔(dān)源〔1〕。因此，應(yīng)該加強對DEP的防治意義重大。由于長期的情志不暢損傷肝腎，耗傷陰精致骨髓失充、髓海失養(yǎng)，腦神不得伸展而成郁，故肝腎陰虛導(dǎo)致的DEP甚為常見，尤多見于疾病中、后期及老年人群。本文通過采用輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激模型+甲狀腺素的方法，造成大鼠抑郁陰虛狀態(tài)，觀察滋腎益腦方對腎陰虛大鼠抑郁模型大鼠行為學(xué)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、酪氨酸激酶受體B(TrKB)基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物 健康SD大鼠，雌雄各半，體重170～190 g(購自長沙開福區(qū)東創(chuàng)科技服務(wù)部)。

1.2藥物及試劑 滋腎益腦方臨床用量為80 g/d，按處方稱取藥材(湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供熟地15 g，何首烏15 g，郁金10 g，丹參15 g，當(dāng)歸15 g，石斛10 g等)，水煎2次，過濾，合并濾液，濃縮成相應(yīng)濃度(浸膏)，4℃保存?zhèn)溆?；鹽酸氟西汀膠囊(PATHEON France，批號：0972A)；甲狀腺素片(濟南維爾康生化制藥有限公司，批號：05055050)；瓊脂糖(西班牙)，DL2000 DNA Marker、dNTP(Genstar)，引物(上海生工)，Trizol(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)，EDTA、Tris(Sigma)，Taq酶(Genstar)。

1.3儀器 敞箱 (自制)由不透明材料制成，底面為100 cm×100 cm的正方形，被等分為25個等邊方格，高50 cm；電子天平(型號：ES-C-600電子天平，湘儀天平儀器有限公司)；低溫大容量離心機(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實業(yè)有限公司型號：KDC-2046)；PCR儀(eppendorf公司)，電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽(北京六一公司)。

1.4方法

1.4.1分組 動物分組試驗前，進行敞箱試驗和液體消耗試驗，根據(jù)敞箱試驗和液體消耗試驗的結(jié)果篩選大鼠，共40只，結(jié)合前期試驗結(jié)果滋腎益腦方中、高劑量組抗抑郁療效優(yōu)于低劑量組，故本實驗隨機分為5組：正常組、模型組、鹽酸氟西汀組(氟西汀組)、滋腎益腦方中劑量組(中劑量組)、滋腎益腦方高劑量組(高劑量組)，每組8只。

1.4.2造模 參考文獻〔2～4〕進行造模，采用灌胃甲狀腺素合并慢性輕度，不可預(yù)見性應(yīng)激法，建立“腎陰虛抑郁病證”復(fù)合模型。造模方法：將4℃冰水游泳5 min，禁食禁水24 h，夾尾1 min，明暗顛倒24 h，陌生物品(如塑料杯、碎布頭等)，潮濕墊料、鼠籠傾，40℃高溫環(huán)境，電擊足底(18 V)，Morris水迷宮。共8種刺激隨機安排在21 d中，每日1種，使大鼠不能預(yù)料刺激發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應(yīng)性。同時，每日灌胃甲狀腺素2.5 mg·kg-1·d-1，造成大鼠抑郁+腎陰虛狀態(tài)。各組從實驗第7日起，氟西汀組給予鹽酸氟西汀3.6 mg·kg-1·d-1；滋腎益腦方中、高劑量分別給予滋腎益腦方14.4、28.8 g 生藥·kg-1·d-1；正常組與模型組均灌胃等容量蒸餾水。各組灌胃容量均為10 ml·kg-1·d-1，1次/d，連續(xù)14 d。除正常組外均單籠飼養(yǎng)。

1.4.3一般狀態(tài)及體重變化 觀察模型動物一般狀態(tài)及體重變化實驗過程中觀察大鼠外表、性情、活動情況、飲水量、大便情況，每周測1次體重。

1.4.4液體消耗試驗〔2,3〕試驗前，在隔噪音、安靜的房間內(nèi)，訓(xùn)練動物適應(yīng)含糖飲水，每籠同時放置2個水瓶，第1個24 h，兩瓶均裝有1%蔗糖水，隨后的24 h，1個瓶裝1%蔗糖水，1個瓶裝純水。23 h禁食禁水后，進行動物的基礎(chǔ)糖純水消耗試驗，同時給予每只大鼠事先定量好的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。60 min后，取走2瓶并稱重。計算動物的糖水偏愛(糖水消耗量/總液體消耗×100%)。

1.4.5敞箱試驗〔2,3〕安靜的房間內(nèi)進行此項試驗觀察。將大鼠置于中心方格內(nèi)，觀察大鼠5 min內(nèi)中央格停留時間(S)、穿越格數(shù)(四爪均進入的方格方可記數(shù)，為水平運動得分)、后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運動得分)、清潔運動記數(shù)、糞便粒數(shù)。徹底清潔敞箱后再進行下1只大鼠的觀察。每只觀察1次。每周進行1次敞箱試驗。

1.4.6BDNF、TrKB基因表達的檢測

1.4.6.1RNA提取 每組取3只進行測定。海馬總RNA采用Trizol 1次性抽提法。取大鼠左側(cè)海馬置入1 ml Trizol中，冰上勻漿，加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩后離心，取上清加等體積異丙醇，-20℃靜置20 min，低溫離心，沉淀中用75%乙醇洗，低溫離心，去上清，空氣干燥5～10 min，加50 μl DEPC處理水溶解沉淀，紫外分光光度計測定濃度。經(jīng)凝膠電泳鑒定，兩條rRNA(18 S、28 S)條帶清晰，紫外分光光度計測A260/A280比值于1.8～2.0之間用于以下實驗。

1.4.6.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 在20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，RNA樣品約3 μg，1 μl自由引物，5×反應(yīng)緩沖液4 μl，RNase抑制劑1 μl，dNTP 2 μl，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 units)1 μl，42℃，1 h 30 min；72℃反應(yīng)10 min。所得cDNA于-20℃凍存。

1.4.6.3引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中目的基因所對應(yīng)的cDNA表達序列和提供的相關(guān)資料，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計上下游引物。①BDNF引物(產(chǎn)物長度為550 bp)：正義鏈：GTTATTTCATACTTCGGTTGC，反義鏈： TGGGATTACACTTGGTCTCG；②TrKB 引物(產(chǎn)物長度為148 bp)：正義鏈：GGCTTATGCTTGCTGGTC，反義鏈：CTGGGTCAATGCTGTTAGGT。

1.4.6.4PCR擴增 取1 μl cDNA上、下游引物各0.5 μl，Taq DNA聚合物0.15 μl，加入10 μl反應(yīng)體系中擴增：(1)BDNF：反應(yīng)條件為94℃，先變性4 min，然后94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)，最后72℃ 5 min。(2)TrKB：反應(yīng)條件為94℃，先變性4 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)，最后72℃ 5 min。

1.4.6.5PCR產(chǎn)物的分析 經(jīng)凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)掃描后，以大鼠海馬β-actin為參照，求出其相對灰度值。

2 結(jié) 果

2.1滋腎益腦方對抑郁大鼠體重及行為學(xué)指標(biāo)的影響 實驗前，各組動物測得的體量、敞箱實驗、液體消耗試驗各項指標(biāo)相近(P>0.05)。治療14 d(應(yīng)激第21天)，與正常組比較，模型組體重、敞箱實驗、液體消耗試驗各項指標(biāo)差異均有顯著性(P<0.01)，提示抑郁模型復(fù)制成功。與模型組比較，敞箱試驗中氟西汀組、滋腎益腦方中、高劑量組在各項指標(biāo)上差異均有顯著性(P<0.01)，說明滋腎益腦方能改善模型動物的抑郁行為。與氟西汀組比較，滋腎益腦方各劑量組各指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異；中劑量組的體重、糖水偏好均明顯增加，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1 治療后各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)的比較

2.2滋腎益腦方對抑郁大鼠BDNF基因表達的影響 在治療14 d(應(yīng)激第21天)后，與正常組比較，模型組大鼠BDNF的mRNA表達明顯降低(0.550±0.62 vs 0.729±0.311，P<0.05)；與模型組比較，氟西汀組、滋腎益腦方中、高劑量組的BDNF mRNA表達升高(0.641±0.49，0.639±0.57，0.684±0.367)，但氟西汀組、滋腎益腦方中劑量組與模型組比較無明顯差異(P>0.05)，高劑量組與模型組比較有明顯差異(P<0.01)。滋腎益腦方組與氟西汀組大鼠海馬BDNF mRNA表達比較無明顯差異(P>0.05)，但海馬BDNF mRNA表達由高到低依次是高劑量組、氟西汀組、中劑量組。見圖1。

圖1 滋腎益腦方對抑郁大鼠BDNF mRNA表達的影響

2.3滋腎益腦方對抑郁大鼠TrKB基因表達的影響 在治療14 d(應(yīng)激第21天)后，與正常組比較，模型組大鼠TrKB的mRNA表達明顯降低(0.245±0.023 vs 0.512±0.105，P<0.05)；與模型組比較，氟西汀組、憂慮康中、高劑量組的TrKB mRNA表達升高(0.447±0.031，0.401±0.078，0.453±0.03，P<0.05，P<0.01)。滋腎益腦方組與氟西汀組大鼠海馬TrKB mRNA表達比較均無明顯差異(P>0.05)，但海馬TrKB mRNA表達由高到低依次是高劑量組、氟西汀組、中劑量組。見圖2。

圖2 滋腎益腦方對抑郁大鼠TrKB mRNA表達的影響

3 討 論

目前DEP的病理生理及發(fā)病機制與海馬結(jié)構(gòu)及功能變化等有密切關(guān)系。已有研究證實，慢性應(yīng)激大鼠中可以導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮、變性及死亡，且應(yīng)激以及抑郁狀態(tài)使腦區(qū)神經(jīng)元尤其是海馬區(qū)再生出現(xiàn)障礙，這可能是DEP發(fā)生的機制之一。

BDNF是一種主要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在海馬和皮層中高水平表達，是神經(jīng)元再生的關(guān)鍵因素〔5，6〕。研究證據(jù)表明BDNF表達水平下降參與DEP的某些病理生理過程。TrKB是BDNF的特異的功能受體，BDNF的作用必須通過TrKB實現(xiàn)。TrKB是由酪氨酸激酶原癌基因編碼的一種神經(jīng)營養(yǎng)素家族高親和力受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對神經(jīng)元的生存、生長、分化有重要的影響〔7〕。TrKB主要作為神經(jīng)營養(yǎng)素家族中BDNF和神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5(NT-4/5) 的特異性高親和力受體。

外源性DEP大鼠(應(yīng)用慢性溫和性刺激制備)及成年內(nèi)源性DEP大鼠(幼鼠腹腔注射五羥色胺再攝取抑制劑-氯米帕明制備)模型，與正常對照組相比，內(nèi)、外源性DEP大鼠腦內(nèi)BDNF水平均較正常組大鼠明顯降低〔8〕。免疫組化法檢測抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)BDNF含量及表達的總面積、陽性細胞數(shù)和平均光密度均明顯降低〔9，10〕。張大鵬等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激致大鼠前腦皮質(zhì)細胞BDNF和TrKB表達減少，褪黑激素對其進行干預(yù)，大鼠相應(yīng)地前腦皮質(zhì)BDNF和TrkB的表達上調(diào)。本實驗研究與上述報道結(jié)果一致，以采用灌胃甲狀腺素合并慢性不可預(yù)見性應(yīng)激制成腎陰虛抑郁動物模型后，模型組海馬區(qū)BDNF、TrKB的基因表達明顯下調(diào)，氟西汀、滋腎益腦方均可在對抗慢性應(yīng)激引起的行為學(xué)變化的同時，使海馬區(qū)BDNF、TrKB基因表達明顯升高，滋腎益腦方高劑量組在BDNF、TrkB基因表達方面明顯尤于氟西汀、滋腎益腦方劑中量組。本文結(jié)果提示，肝腎陰虛抑郁模型腦內(nèi)海馬區(qū)TrkB的表達減少，可能是神經(jīng)細胞可塑性下降、細胞凋亡與再生平衡失調(diào)的原因之一，進而導(dǎo)致局部性結(jié)構(gòu)和功能障礙，引起認知、情感等改變。滋腎益腦的作用機制之一可能是通過促進海馬BDNF、TrKB基因表達上調(diào)。

4 參考文獻

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