葉豆丹 郭淑婷 潘 志 劉慶彬 王穎航

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117)

慢性腎病(CKD)的發(fā)病率逐漸增加，由于其病程長(zhǎng)、治療費(fèi)用昂貴，給社會(huì)及家庭帶來經(jīng)濟(jì)和精神上的負(fù)擔(dān)。腎纖維化是大多數(shù)CKD發(fā)展至終末期腎衰竭的共同通路，而且纖維化進(jìn)程與腎衰竭等級(jí)相關(guān)〔1,2〕。逆轉(zhuǎn)或延緩腎纖維化進(jìn)程成為治療CKD的突破口。腎纖維化過程中有多種細(xì)胞因子參與，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、信號(hào)傳導(dǎo)分子(Smad2)、Smad7等〔3～6〕。其中TGF-β1被廣泛認(rèn)為是腎纖維化過程中的關(guān)鍵因子，任何一種CKD都能發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)上調(diào)〔7〕。CTGF為TGF-β1下游調(diào)節(jié)因子，能夠增強(qiáng)TGF-β1的致纖維化效應(yīng)〔8〕。本實(shí)驗(yàn)以TGF-β1為刺激因子誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法研究消癥活絡(luò)方藥對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)HK-2轉(zhuǎn)分化的拮抗作用。

1 對(duì)象與方法

1.1試劑及儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱：SANYO公司；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化公司；倒置顯微鏡：上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；DMEM高糖培養(yǎng)基：美國GIBCO公司；胎牛血清(BSA)：HyClone公司；噻唑蘭(MTT)：美國SIGMA公司；TGF-β1：PEPROTECH公司；鹽酸貝那普利：北京諾華制藥有限公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、CTGF及免疫組化試劑盒：武漢博士德公司，Wistar大鼠購自吉林大學(xué)動(dòng)物部。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人近端HK-2常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：DMEM高糖培養(yǎng)基+10%BAS作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO2濃度為5%，0.25%胰蛋白酶+1%乙二胺四乙酸(EDTA)作為消化液用于細(xì)胞傳代。

1.2.2含藥血清制備 健康雄性Wistar大鼠30只，體重為230～280 g，隨機(jī)分為空白組、陽性組及中藥組，每組10只，每天清晨灌胃(其中空白組灌胃蒸餾水，陽性組灌胃鹽酸貝那普利溶液，中藥組灌胃消癥活絡(luò)方藥水煎劑)，給藥劑量按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等效劑量的折算方法換算，以最大劑量灌胃，連續(xù)給藥7 d，1次/d。最后一次給藥2 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h左右 ，1 000 r/min離心，取上層血清，合并同組血清，56℃滅活30 min，0.22 u濾器過濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3MTT法檢測(cè)HK-2增殖 HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期消化后，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105后，接種于96孔板，同時(shí)接種3塊板，即24、48、72 h板。根據(jù)實(shí)驗(yàn)預(yù)試每板分為空白對(duì)照組、TGF-β1組、消癥活絡(luò)方藥5%含藥血清組(方藥1組)、消癥活絡(luò)方藥10%含藥血清組(方藥2組)、陽性對(duì)照鹽酸貝那普利含藥血清組(陽性對(duì)照組)；每組6個(gè)復(fù)孔，100 μl/孔。細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底后換無血清DMEM培養(yǎng)基同步24 h。細(xì)胞同步后棄掉上清液，按以上分組加入受試物，分別于給藥后4、24、48、72 h用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)α-SMA及CTGF表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105，將高壓滅菌的細(xì)胞爬片置于6孔板內(nèi)，將細(xì)胞懸液鋪于細(xì)胞爬片上，100 μl/片，面積盡量大但不能超出爬片，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～5 h使細(xì)胞貼壁，每孔補(bǔ)加2 ml培養(yǎng)基，換無血清培養(yǎng)基同步24 h，棄掉上清液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)預(yù)試每板分為空白對(duì)照組、TGF-β1組、消癥活絡(luò)方藥含藥血清組、陽性對(duì)照含藥血清組。收集細(xì)胞爬片，免疫組化法檢測(cè)α-SMA及CTGF表達(dá)率。按免疫組化試劑盒說明操作，10%甲醛固定30 min，空氣干燥5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.2～7.6)洗2 min 3次。30%H2O2加純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，蒸餾水洗2 min 3次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。滴加α-SMA(1∶50稀釋)或CTGF(1∶50稀釋)，4℃過夜，PBS洗2 min 3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，20℃～37℃ 20 min，PBS洗2 min 3次。滴加鏈霉素和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑，20℃～37℃ 20 min，PBS洗5 min 4次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明、封片。每組隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算陽性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1MTT比色法檢測(cè)清癥活絡(luò)方藥對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)HK-2增殖的影響 各組OD值均比TGF-β1組小(P<0.05)，消癥活絡(luò)方藥血清組和陽性對(duì)照含藥血清組OD值均較TGF-β1組小(P<0.05)。見表1。

表1 MTT比色法檢測(cè)消癥活絡(luò)方藥對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2增殖的影響

2.2免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)α-SMA和CTGF表達(dá)結(jié)果 空白組基本未見α-SMA表達(dá),細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石樣,TGF-β1處理組細(xì)胞在48 h開始出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變,大量細(xì)胞由立方鋪路石樣轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮烷L(zhǎng)條狀,細(xì)胞肥大,72 h更加明顯,72 h進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色見大量細(xì)胞胞漿內(nèi)強(qiáng)烈表達(dá)α-SMA。TGF-β1組的α-SMA和CTGF陽性細(xì)胞很明顯多于空白對(duì)照組(P<0.05)，消癥活絡(luò)方藥組和陽性對(duì)照含藥血清組明顯少于TGF-β1組和空白組(P<0.05)。見表2。

表2 消癥活絡(luò)方藥對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞α-SMA和CTGF表達(dá)的影響

3 討 論

TGF-β1是公認(rèn)的促纖維化因子〔9〕，5 ng/ml的TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞，可誘導(dǎo)其增殖〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，可見消癥活絡(luò)方藥可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖。肌成纖維細(xì)胞被稱為腎纖維化的關(guān)鍵媒介，其被TGF-β1等細(xì)胞因子活化后分泌細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白和纖維連接蛋白〔11〕。α-SMA被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白〔12〕，可以作為診斷腎纖維化程度的標(biāo)準(zhǔn)。正常HK-2細(xì)胞基本不表達(dá)α-SMA，當(dāng)TGF-β1刺激后，發(fā)生小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)作用，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，隨著纖維化程度加重肌成纖維細(xì)胞增多，進(jìn)而α-SMA表達(dá)增加。 EMT 主要包括下列4 個(gè)關(guān)鍵步驟〔13〕:(1)上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間連接的特性；(2)新合成并表達(dá)α- SMA，以及細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白質(zhì)actin的重新構(gòu)建;(3)組織基底膜完整性破壞;(4)細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力增強(qiáng)等。EMT已經(jīng)被證實(shí)是腎臟纖維形成的最初機(jī)制〔14〕。CTGF是TGF-β1的下游作用因子，TGF-β1活化可以增加CTGF表達(dá)，而CTGF可以刺激肌成纖維細(xì)胞增殖并能增加ECM合成，推動(dòng)TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化進(jìn)程，被稱為成纖維細(xì)胞的引誘物。CTGF還可以從其他途徑產(chǎn)生，直接并獨(dú)立地誘導(dǎo)EMT〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TGF-β1可以刺激HK-2細(xì)胞表達(dá)α-SMA和CTGF，發(fā)生小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，另外消癥活絡(luò)方藥可在一定程度上拮抗EMT作用。消癥活絡(luò)方藥含藥血清顯著減少了表達(dá)CTGF的陽性細(xì)胞數(shù)，空白血清卻無此作用，所以推斷CTGF是消癥活絡(luò)方藥拮抗EMT的一個(gè)作用點(diǎn)，可能通過TGF-β1/Smads途徑，減少CTGF的產(chǎn)生進(jìn)而抑制肌成纖維細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成，從而減輕腎纖維化的程度。

4 參考文獻(xiàn)

1遲雁青,林海英,張 濤,等.腎炎四味片可減輕5/6腎切除大鼠的腎臟纖維化〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013;35(2):127-31.

2Eddy AA.Progression in chronic kidney disease〔J〕.Adv Chronic Kidney Dis,2005;12(4):353-65.

3王 東,張 江,吳同茹,等.淫羊藿有效單體對(duì)活化的腎成纖維細(xì)胞株和系膜細(xì)胞株的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2012;13(11):956-9.

4Burns WC,Kantharidis P,Thomas MC,etal.The role of tubular epithelial-mesenchymal transition in progressive kidney disease〔J〕.Cells Tissues Organs,2007;185(1-3):222-31.

5宋純東,薛黎明.雷公藤多苷對(duì)早期糖尿病腎病大鼠腎小管上皮細(xì)胞Smad2的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2012;13(3):233-4.

6任韞卓,段惠軍,史永紅,等.p -Smad2/3、Smad7在大鼠實(shí)驗(yàn)性腎間質(zhì)纖維化模型中的表達(dá)〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2006;26(8):871-6.

7Catania JM,Chen G,Parrish AR,etal.Role of matrix metalloproteinases in renal pathophysiologies.Am.Physiol〔J〕.Renal Physiol,2006;292:F905-11.

8Prudhomme GJ.Pathobiology of transforming growth factor (beta) in cancer,fibrosis and immunologic disease,and therapeutic considerations〔J〕.Lab Invest,2007;87:1077-91.

9王 東,何立群.健脾清化方有效單體對(duì)活化的腎成纖維細(xì)胞株和系膜細(xì)胞株增殖的影響〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012;28(9):948-51.

10劉明龍,曾永祥,盧守燕,等.復(fù)腎顆粒對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞TAK1表達(dá)的影響〔J〕.中成藥,2011;33(2):222-5.

11Shin DH,Park HM,Jung KA,etal.The NRF2-heme oxygenase-1 system modulates cyclosporin A-induced epithelial-mesenchymal transition and renal fibrosis〔J〕.Free Radi Biol Med,2010;48(8):1051-63.

12崔 瑾,王耀獻(xiàn),孫衛(wèi)衛(wèi),等.和解聚散方對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織α-SMA表達(dá)的影響〔J〕.中醫(yī)藥信息,2012;29(1):28-30.

13劉進(jìn)穩(wěn),辛冰牧,慕 容,等.TRB3 在腎纖維化中的表達(dá)及其與上皮-間葉轉(zhuǎn)化的關(guān)系〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào),2012;28(3):407-11.

14Radisky DC,Kenny PA,Bissell MJ.Fibrosis and cancer:do myo fibroblasts come also from epithelial cells via EMT cell〔J〕.Biochem，2007；101(4):830-9.

15Takakuta K,Fujimori A.Renoprotective properties of pirfenidone in subtotally nephrectomized rats〔J〕.Eur J Pharmacol,2010;629(1-3):118-24.