尉 娜 王建平 路 坦

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

AMP激活的蛋白質(zhì)激酶(AMPK)是一種保守的異源三聚體蛋白激酶，其活力能夠被AMP上調(diào)。AMPK通常被認(rèn)為是一種應(yīng)激反應(yīng)酶，在體內(nèi)葡萄糖缺乏、缺氧、缺血及熱休克等引起AMP/ATP比例升高的情況下，細(xì)胞內(nèi)的AMPK即可被激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為〔1〕。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是與AMPK相反的能量感應(yīng)器〔2〕，在能量缺乏時(shí)被抑制，能量充足時(shí)被激活。mTOR可接受并整合細(xì)胞內(nèi)外的各種刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、存活、自噬、凋亡等生理過程〔3〕。本研究中觀察到缺氧可抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和代謝，并促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)缺氧可通過激活A(yù)MPK通路，進(jìn)而抑制mTOR通路的活化，從而抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和代謝。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3細(xì)胞(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系惠贈(zèng))。

1.2試劑與抗體 高糖DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；CCK8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所；兔抗人p-AMPK抗體、兔抗人p-mTOR抗體購自Cell Signaling Technology 公司；mTOR抑制劑雷帕霉素(RAPA)、DCFH-DA購自Sigma-Aldrich 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購自Lonza 公司；AMPKα siRNA 序列、Annexin V/PI染色試劑盒購自Invitrogen公司；CytoBuster 蛋白提取試劑購自Novagen公司；硝酸纖維素膜購自GE公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，常氧組細(xì)胞置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。低氧處理組置于三氣數(shù)字培養(yǎng)箱內(nèi)，用混合氣(80% N2、5%CO2、15%O2)、(85% N2、5%CO2、10%O2)、(90% N2、5%CO2、5%O2)、 (94% N2、5%CO2、1%O2)置換法進(jìn)行低氧培養(yǎng)。細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，用胰酶消化傳代，并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行換液。

1.4細(xì)胞增殖檢測(cè) bEnd.3細(xì)胞接種于96孔板上。待16～18 h后貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，按上述缺氧條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別向每孔中加入10 μl CCK8，繼續(xù)孵育1 h。450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

1.5ROS含量測(cè)定 bEnd.3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，重懸于PBS中。加入1 μl DCFH-DA，避光，37℃放置30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，1% BSA PBS洗滌1次。用100 μl Binding緩沖液將細(xì)胞重懸，加入2 μl Annexin V染料和0.1 μl PI染料，避光15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7細(xì)胞處理 干擾AMPK時(shí)分別采用AMPKα1特異的siRNA和siRNA干擾過夜。處理細(xì)胞的RAPA濃度為10 nmol/L。

1.8細(xì)胞總蛋白提取 上述細(xì)胞用冰PBS洗滌2次，離心400 r/min 5 min；將離心后的上清棄去，細(xì)胞沉淀輕輕彈勻，加入蛋白酶磷酸酶抑制劑和100 μl CytoBuster 蛋白提取試劑，高速渦旋細(xì)胞裂解混合物25 s，室溫放置15 min；將細(xì)胞裂解混合物低溫高速離心，4℃，12 000 r/min離心15 min；所得上清部分即細(xì)胞總蛋白，除留部分樣品檢測(cè)蛋白濃度外，其余分裝15 μl/管，-80℃凍存。

1.9BCA法測(cè)定蛋白濃度 按說明書倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品BSA；按體積比50∶1 混合BCA試劑A和試劑B，混合液為備用工作液；在96孔板中進(jìn)行測(cè)定，每孔加入200 μl/孔工作液，隨后加入25 μl倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，每種樣品設(shè)置3復(fù)孔。振蕩器短暫振蕩混勻30 s；37℃孵育30 min；振蕩器短暫混勻后在波長(zhǎng)562 nm 處測(cè)定OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值和濃度梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品的OD 值推算各蛋白樣品濃度。

1.10Western印跡 等量提取的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以含5% BSA 的TBST室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜孵育。第二天用0.1% TBST 洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST 洗膜后，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto HRP 敏感化學(xué)發(fā)光底物對(duì)條帶進(jìn)行顯色。Actin作為內(nèi)參對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1缺氧對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和代謝的影響 缺氧可顯著抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ROS代謝；且隨著氧濃度降低，缺氧對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS代謝的抑制也逐漸增強(qiáng)。見表1。

表1 不同氧濃度對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和代謝的影響

2.2缺氧促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 缺氧處理后，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率相比正常氧對(duì)照組明顯升高(圖1)。

圖1 缺氧對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響

2.3缺氧對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化的影響 缺氧處理腦血管內(nèi)皮細(xì)胞后，隨著氧濃度的降低，AMPK蛋白磷酸化水平逐漸升高。見表2，圖2。

表2 腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平定量

2.4缺氧對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中mTOR蛋白磷酸化的影響 缺氧處理腦血管內(nèi)皮細(xì)胞后，隨著氧濃度的降低，mTOR蛋白磷酸化水平逐漸降低。見表3，圖3。

圖2 Western印跡檢測(cè)缺氧處理腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平

圖3 Western印跡檢測(cè)缺氧處理腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中mTOR蛋白磷酸化水平

表3 腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中mTOR蛋白磷酸化水平定量

2.5AMPK蛋白位于mTOR蛋白上游 以AMPKα1 siRNA敲低腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK蛋白后，mTOR蛋白磷酸化水平顯著升高(圖4A)。以mTOR信號(hào)通路抑制劑RAPA處理腦血管內(nèi)皮細(xì)胞后，AMPK蛋白磷酸化水平未受到顯著影響(圖4B)。

圖4 Western印跡檢測(cè)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK蛋白和mTOR蛋白磷酸化水平

3 討 論

國內(nèi)外研究結(jié)果表明，腦血管疾病多伴發(fā)缺血缺氧。腦的耗氧量約占機(jī)體總耗氧量的20%，而且腦組織對(duì)缺氧的耐受性差，短時(shí)間缺氧即可造成神經(jīng)元死亡〔4〕。缺氧應(yīng)激可激活A(yù)MPK途徑，激活的AMPK除在能量代謝方面起重要作用外，還參與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞的分裂周期，從而抑制細(xì)胞的增殖〔5〕。mTOR是一種保守的絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化中具有重要的調(diào)節(jié)作用〔6〕，可在多種因素的活化下參與密碼子翻譯起始、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能〔7〕。有研究認(rèn)為激活的AMPK可以抑制由生長(zhǎng)因子和氨基酸刺激激活的mTOR信號(hào)途徑，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為〔8〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著氧濃度的逐漸降低，缺氧對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和代謝抑制逐漸增強(qiáng)。缺氧條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，隨著氧濃度的降低，細(xì)胞凋亡率逐漸增加；且隨著氧濃度的逐漸降低，AMPK的磷酸化水平顯著增加，而mTOR的磷酸化水平顯著降低。提示缺氧可能通過激活A(yù)MPK途徑，進(jìn)而抑制mTOR途徑，從而對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、代謝以及凋亡產(chǎn)生影響。敲低AMPK后，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中mTOR的磷酸化水平較未敲低組明顯增加，表明AMPK確實(shí)對(duì)mTOR存在抑制作用，且mTOR為AMPK通路下游的靶蛋白。以mTOR通路抑制劑處理腦血管內(nèi)皮細(xì)胞后，AMPK的磷酸化水平較對(duì)照組未出現(xiàn)顯著的變化，進(jìn)一步證實(shí)了mTOR為AMPK通路下游的靶蛋白。

綜上，缺氧可通過激活腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的AMPK通路，進(jìn)而抑制mTOR的磷酸化水平，從而抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和代謝，并促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，AMPK和mTOR之間的相互拮抗作用對(duì)它們調(diào)控腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和代謝起到了一定的作用。

4 參考文獻(xiàn)

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