蔡華珍 李冬雪 肖和平

(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000)

傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)與近來的研究認(rèn)為，烏雞黑色素具有滋補(bǔ)、抗衰老、抗疲勞、調(diào)理機(jī)體平衡等作用，是烏雞滋補(bǔ)健身、延緩衰老的物質(zhì)基礎(chǔ)〔1，2〕。在烏雞黑色素性質(zhì)的研究上實(shí)驗(yàn)已證明：烏雞黑色素具有抗氧化作用〔2～4〕；通過對果蠅喂飼研究發(fā)現(xiàn)，烏雞黑色素能夠顯著延長果蠅的平均壽命〔5〕，然而在對小鼠體內(nèi)的抗氧化指標(biāo)的研究上卻未發(fā)現(xiàn)與對照組有顯著差異〔6〕。本研究旨在探討烏雞黑色素對衰老模型小鼠的肝臟、大腦及血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)以及相關(guān)臟器的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小鼠，雌雄各半，平均體重24～30 g，購自安徽科技學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2主要藥品與試劑 烏雞黑色素：從泰和烏雞(購自江西省泰和縣生物谷食品科技工業(yè)園)中提??；D-半乳糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；考馬斯亮藍(lán)G250(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)；牛血清清蛋白(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。無水乙醇、冰乙酸、石油醚、乙醚、氯化鈉等均為分析純； SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3方法

1.3.1烏雞黑色素的提取工藝〔7〕全凈膛烏雞→剔骨取肉→絞碎→加熱(肉水比1∶1，100℃ 5 min)→木瓜蛋白酶酶解→風(fēng)味酶酶解→滅酶→過濾→離心→收集沉淀物→醚洗、水洗至pH中性→沉淀物→凍干→黑色素。

1.3.2小鼠的分組及造?！?，9〕昆明種小鼠80只，3月齡左右。普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)6 d后，將小鼠隨機(jī)分為8組，其中，4組用于生理生化指標(biāo)的測量，另4組用于臟器指數(shù)的測定，兩者分組相同，即每組10只，正常對照組、模型組、黑色素低劑量組，黑色素高劑量組。各組連續(xù)灌胃、注射43 d。模型組每日頸背部皮下注射D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1，并灌胃與黑色素組等體積的0.1%瓊脂液；正常對照組每日頸背部皮下注射等體積滅菌生理鹽水，灌胃與黑色素組等體積的0.1%瓊脂液；黑色素組每日頸背部皮下注D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1，黑色素低、高劑量組分別按900、1 800 mg·kg-1·d-1劑量灌胃黑色素，黑色素用0.1%瓊脂液分散。每周記錄1次體重，隨時(shí)觀察小鼠的生長情況。小鼠行動遲緩、毛色松散無光澤、自發(fā)性活動減少、形體瘦弱、呈現(xiàn)明顯的衰老特征時(shí)，證明衰老模型建立成功。于末次給藥1 d后，摘除眼球取血分離血清，4℃低溫保存?zhèn)溆?；頸椎脫臼法處死動物，快速分離肝臟和腦組織，于-20℃凍存?zhèn)溆?。進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.3.3MDA含量、SOD、GSH-Px活力的測定 嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定肝、腦組織以及血清中的MDA含量，SOD、GSH-Px活力。

1.3.4組織蛋白含量測定 考馬斯亮藍(lán)法〔10〕。

1.3.5小鼠器官指數(shù)的測定〔11〕頸椎脫臼法處死動物，快速取出腦、胸腺、脾、肝、腎，剔除表面脂肪，用4℃生理鹽水沖凈表面殘血，用濾紙吸收水分，精確稱取其重量，按照以下公式計(jì)算：器官指數(shù)=器官重(mg)/體重(g) 。

2 結(jié) 果

2.1烏雞黑色素對D-半乳糖衰老模型小鼠體貌特征及體重的影響 實(shí)驗(yàn)開始2 w后，模型組小鼠毛發(fā)出現(xiàn)凌亂無光現(xiàn)象，注射處開始出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，其他組無此現(xiàn)象。4 w后模型組小鼠行動較為遲緩，毛色松散無光澤，炎癥加劇，但黑色素組小鼠生長良好，毛發(fā)光亮濃密，活潑好動，至第42天黑色素組模型小鼠一直生長良好，而模型組體形消瘦，脊椎隆起，行動遲緩。用藥后14 d內(nèi)各組小鼠體重?zé)o明顯差異；到第21天，模型組體重比黑色素高劑量組的明顯降低(P<0.05)，但與其他各組間無顯著差異；第35天時(shí)，模型組體重均低于其他各組(P<0.05)；到了第42天，模型對照組與其他各組之間差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)，并且正常對照組的體重亦低于黑色素高劑量組(P<0.05)。這說明烏雞黑色素能夠抵御D-半乳糖的致衰老干擾，促進(jìn)衰老模型小鼠的生長。見表1。

表1 烏雞黑色素對D-半乳糖衰老模型小鼠體重的影響

2.2烏雞黑色素對D-半乳糖衰老模型小鼠肝臟、大腦、血清中SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響 正常對照組、黑色素組小鼠肝臟、大腦、血清中的SOD、GSH-Px活力極顯著高于模型組(P<0.01)，與黑色素低劑量組比較，高劑量黑色素對D-半乳糖致衰小鼠大腦中GSH-Px活力影響更顯著(P<0.01)，但黑色素各劑量組之間肝臟、大腦、血清中的SOD差異均不顯著。因此，烏雞黑色素能顯著提高D-半乳糖致衰小鼠肝臟、大腦、血清中的SOD、GSH-Px活力。見表2，表3。

在對MDA含量的影響方面，衰老模型組小鼠肝臟、大腦和血清中MDA含量均極顯著高于其他各組(P<0.01)；黑色素高、低劑量組間肝臟和血清中MDA含量差別不大，但是大腦的MDA含量，卻是高劑量組極低于低劑量組(P<0.01)，這與黑色素高劑量組大腦中GSH-Px高活力相對應(yīng)。表明烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷有保護(hù)作用，尤其對大腦保護(hù)作用更顯著，其保護(hù)作用與黑色素成正比。見表4。

表2 烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠肝臟、大腦和血清中SOD的影響

2.3烏雞黑色素對D-半乳糖衰老模型小鼠器官指數(shù)的影響 黑色素組各器官指數(shù)均極顯著高于模型組(P<0.01)，略高于正常對照組(P>0.05)。黑色素高劑量組各器官指數(shù)亦略高于黑色素低劑量組，但差異不顯著，說明黑色素可顯著提高D-半乳糖致衰小鼠的器官指數(shù)，但黑色素劑量影響差別不大。見表5。

表3 烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠肝臟、大腦和血清中GSH-Px的影響

表4 烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠肝臟、大腦和血清中MDA的影響

表5 烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠腦指數(shù)和臟器指數(shù)的影響

3 討 論

隨著年齡的增長，機(jī)體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)如SOD、GSH-Px等功能下降，這種平衡逐漸被破壞，造成自由基過剩。過量自由基可通過過氧化作用攻擊細(xì)胞膜及核酸、蛋白質(zhì)和酶類等生物大分子，造成生物膜的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，DNA基因突變或復(fù)制異常及生物酶活力下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能嚴(yán)重受損以至衰老、死亡〔12〕。

MDA是體內(nèi)自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其含量可間接判斷體內(nèi)自由基對機(jī)體的損傷程度以及衰老的程度；SOD能及時(shí)清除機(jī)體生成的過量自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的攻擊，因而SOD活力的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力；GSH-PX是機(jī)體廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異性地催化還原型GSH對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整作用〔12，13〕。

因此，通過測定自由基清除系統(tǒng)的SOD、GSH-Px等活力，以及MDA含量，可以觀察肌體的氧化損傷情況。

D-半乳糖所致亞急性衰老模型是與自然衰老所出現(xiàn)的生化改變相近的實(shí)驗(yàn)動物模型〔14〕。D-半乳糖可導(dǎo)致糖代謝紊亂，蛋白質(zhì)、脂肪代謝異常，使體細(xì)胞發(fā)生退行性變化，產(chǎn)生多項(xiàng)生化指標(biāo)變化，如SOD等活性降低和MDA水平升高等〔13，15〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示烏雞黑色素能提高衰老模型小鼠機(jī)體清除自由基的能力，降低機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，烏雞黑色素具有延緩衰老之功能。

但是，這一結(jié)果與胡泗才等〔3，16，17〕研究烏雞黑色素對老齡小鼠紅細(xì)胞及肝細(xì)胞SOD活性沒有明顯影響；對老齡小鼠的血漿過氧化脂質(zhì)含量也沒有明顯影響結(jié)果不同。對此，周偉偉等〔18〕分析認(rèn)為，烏雞黑色素性質(zhì)較穩(wěn)定，難溶于水等溶劑，胡泗才等試驗(yàn)效果不理想的原因是未能找到溶解烏雞黑色素的溶劑，從而造成烏雞黑色素在機(jī)體內(nèi)吸收效果不夠理想。但本研究認(rèn)為，胡泗才等的結(jié)果可能是黑色素的飼喂方式所致，由于他們均采用將烏雞黑色素加入小鼠飼料中喂養(yǎng)，而小鼠的習(xí)性會啃咬部分食物用來磨牙，從而使得烏雞黑色素?cái)z入量不夠。本試驗(yàn)采用灌胃法則避免了黑色素的損失，烏雞黑色素的難溶性并未影響試驗(yàn)效果，相反小鼠吸收效果良好，這也可能與小鼠的胃腸液功能等有關(guān)，具體的吸收機(jī)制目前尚不清楚。

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