劉金霞 郭爭(zhēng)榮 孫殿興 吳松柏

(承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 050098)

細(xì)胞外基質(zhì)沉積和降解失去平衡是肝細(xì)胞損傷后導(dǎo)致肝纖維化的主要原因。目前，臨床上還缺乏確切有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化藥物，以冬蟲(chóng)夏草、丹參和復(fù)方 861 合劑、鱉甲軟肝片等具有活血化瘀、軟堅(jiān)散節(jié)功效的單方或復(fù)方中藥制劑具有比較好的抗肝纖維化療效。中藥組方能夠多環(huán)節(jié)、多層次及多靶點(diǎn)的綜合作用，具有廣闊的抗纖維化開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。本研究通過(guò)建立硫代乙酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝硬化模型，采取不同時(shí)間和不同劑量分別觀察軟肝升白顆粒對(duì)層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)含量的影響，以及肝組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及其受體c-Met mRNA的表達(dá)水平，旨在探討軟肝升白顆?？估w維化的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 軟肝升白顆粒由白求恩國(guó)際和平醫(yī)院制劑科配制，復(fù)方鱉甲軟肝片由解放軍302醫(yī)院研制，內(nèi)蒙古集寧制藥廠饋贈(zèng)，生產(chǎn)批號(hào)20060609；硫代乙酰胺(TAA)購(gòu)買于Sigma公司； HA、LN檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所；清潔級(jí)Wistar雄性小鼠100只，體重(18±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2造模和分組給藥 TAA用精確度為1/萬(wàn)的電子天平稱取并用飲用水稀釋，采用TAA誘導(dǎo)法制備小鼠肝纖維化模型。20只為正常組(E組)，用飲用水喂養(yǎng)，其余均用0.03%TAA誘導(dǎo)飼喂〔1〕，每1～2 d更換1次飲用水，誘導(dǎo)時(shí)間20 w。造模成功后隨機(jī)分為四組，每組20只， A組小鼠給予軟肝升白顆粒8 g·kg-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量7倍)灌胃，B組給予4 g·kg-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量3.5倍)灌胃，C組小鼠給予鱉甲軟肝片0.8 g·kg-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量的7倍)灌胃，D組(模型對(duì)照組)和E組分別給予等體積的生理鹽水灌胃，造模結(jié)束后，停用TAA 1 w后，給予上述藥物治療，1次/d〔2〕。

1.3標(biāo)本留取和指標(biāo)檢測(cè) 分別在治療后第4、8周處死小鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，由我院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能，應(yīng)用放射免疫法檢測(cè)小鼠血清HA、LN等肝纖維化指標(biāo)，盡可能無(wú)菌條件下取部分肝組織，0.5×0.5×0.5 cm3，迅速液氮冷凍保存。TRIZOL試劑提取肝組織總RNA，合成cDNA第一條鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，嚴(yán)格按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作〔3〕。HGF正向引物5′TCAAATGCCAGCCTTGGAATTCC-3′，反向引物5′TCAAGAGTGTAGCACCATGGC-3′，片段385 bp，退火52℃，循環(huán)數(shù)32；C-met正向引物5′AGCTGTACCTTGACCTTAAGC3′，反向引物5′TTCAGGGTCTTCCCAATACC-3′,片段479 bp，退火54℃，循環(huán)數(shù)30；GAPDH正向引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，片段651 bp,退火54℃,循環(huán)數(shù)33。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，并進(jìn)行半定量分析，以目的基因條帶光密度值與內(nèi)參照GAPDH條帶光密度值比，表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS8.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1軟肝開(kāi)自顆粒治療小鼠肝纖維化不同時(shí)間肝功能水平 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)和總膽紅素(TBil)見(jiàn)表1。

2.2血清HA、LN的變化 HA、LN與肝組織學(xué)變化呈正相關(guān)。與E組相比，D組HA、LN均升高(P<0.05)，與D組相比，治療4 w，A、B、C組HA、LN均有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。治療8 w，A、B、C組HA、LN均有明顯下降(P<0.05)，而A組HA、LN水平下降較B和C組明顯(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 軟肝升白顆粒治療小鼠肝纖維化不同時(shí)間肝功能水平

表2 軟肝升白顆粒治療小鼠肝纖維化不同時(shí)間血清

2.4HGF/c-Met系統(tǒng)在各組肝組織中的表達(dá)水平 圖1可見(jiàn)，治療4 w時(shí)，HGF/c-Met的表達(dá)水平在A組明顯高于其他各治療組和E組(P<0.05)，但B組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，D組與E組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。治療8 w時(shí)，隨著肝損傷的好轉(zhuǎn)，HGF/c-Met的表達(dá)水平有所下降，但在軟肝升白顆粒A組HGF/c-Met的表達(dá)水平高于B、D、E其他各組(P<0.05)。

圖1 HGF/c-Met系統(tǒng)在各組肝組織中的表達(dá)

3 討 論

肝纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“瘤”、“痹”、“痞”、“積”等范疇。由于痰瘀互結(jié)，全身氣、血、津液運(yùn)行不暢，陰陽(yáng)失調(diào)，最終形成肝纖維化。軟肝升白顆粒由黃芪、丹參、當(dāng)歸、桃仁、白術(shù)、黨參、梔子、茵陳等16味中藥組成，具有活血軟堅(jiān)、化痰除濕功效。尤其是丹參和黃芪，屬于活血化瘀和補(bǔ)中益氣類中藥，在臨床以及實(shí)驗(yàn)研究中都被證實(shí)有較明確的抗肝纖維化作用，有研究〔4〕認(rèn)為與其下調(diào)炎性細(xì)胞因子、阻斷肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞(HSC)活化、減少膠原組織的合成及促進(jìn)自由基清除和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)。本研究通過(guò)應(yīng)用軟肝升白顆粒治療小鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)小鼠肝功能、肝纖維化指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，檢測(cè)HGF/c-MetmRNA水平，進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)HGF/c-MetmRNA高表達(dá)，HGF能夠刺激肝細(xì)胞再生，抑制受損肝細(xì)胞凋亡的活性物質(zhì)，具有抗肝損傷和抗肝纖維化作用〔5〕。其受體是c-Met原癌基因編碼的一種跨膜酪氨酸激酶，HGF與其結(jié)合，引起酪氨酸激酶活化，激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括磷脂酰肌醇-3(PI-3K)、Grb/sos/Ras復(fù)合物、Gab-1、Shp-2、磷脂酶C、Ras-GTP酶活性蛋白和c-Scr等，從而使HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路處于激活狀態(tài)，并進(jìn)一步調(diào)控DNA的合成、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中起重要作用的相關(guān)基因的表達(dá)，最終使細(xì)胞進(jìn)入增殖期而發(fā)揮作用〔6〕。已知在四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝纖維化模型中HGF組能夠促進(jìn)莖質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13表達(dá)的同時(shí)，抑制MMP抑制劑(TIMP)-1的表達(dá)，MMP-13可與TIMP-1以1∶1非共價(jià)結(jié)合使其降解膠原活性受抑制〔6〕。因此，軟肝升白顆粒能夠通過(guò)提高HGF及其受體c-Met mRNA的表達(dá)，經(jīng)過(guò)上述多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，改善肝功能的同時(shí)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，逆轉(zhuǎn)肝纖維化〔7〕。

4 參考文獻(xiàn)

1張 杰,陳積圣,王 坤,等.硫代乙酰胺誘導(dǎo)肝硬化模型方法的改進(jìn)〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,1999;16(6): 567.

2章元沛.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:238.

3Okuyama H,Nakamura H,Shimahara Y,etal. Overexpression of thioredoxin prevents thioacetamide-induced hepatic fibrosis in mice〔J〕.J Hepatol,2005;42:117-23.

4Liu Y.Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis：therapeuitc potential and mechanisms of action 〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;287(1) :F7-16.

5Matsumoto K,Nakamura T.Hepatocyte growth factor：renotroptic role and potential therapeuics for renal diseases〔J〕.Kidney Int,2009;59(6) :2023-38.

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7Kim WH,Matsmoto K,Bessho K,etal.Growth inhibition and apoptosis in liver myofibroblasts promoted by hepatocyte growth factor leads to resolution from liver cirrhosis〔J〕. Am J Pathol,2005;166(14) :1017-28.