宓 偉 郝延璋 衣衛(wèi)杰 練 武 曲 巍 韓文婷

(濱州醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，山東 煙臺 264003)

我國乳腺癌發(fā)病率為8%～12%，并且逐年上升〔1〕。 erbB-2基因過表達(dá)是乳腺癌病變因素之一，25%～45%的乳腺癌患者因該基因而發(fā)病，更為嚴(yán)重的是該種基因誘發(fā)的乳腺癌具有極高的轉(zhuǎn)移率和致死率。有研究顯示，飲食和環(huán)境因素是影響erbB-2基因過表達(dá)的重要原因之一〔2〕。臨床認(rèn)為大豆異黃酮(GST)是腫瘤化學(xué)預(yù)防重要物質(zhì)之一，其與腫瘤生成和發(fā)展有極大相關(guān)性〔3～5〕。本文觀察轉(zhuǎn)基因MMTV-erbB-2小鼠進行GST喂養(yǎng)對乳腺癌相關(guān)激素及受體的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇體重20～22 g的雌性轉(zhuǎn)基因MMTV-erbB-2小鼠80只，購自南京市江寧區(qū)青龍山養(yǎng)殖基地，許可證號：SCXK(蘇)2009-0002。于(25±1)℃、RH45%～65%條件下飼養(yǎng)；40只給予GST進行飼養(yǎng)，作為觀察組；另40只給予普通飼料(含有玉米、面粉、麩皮等)進行飼養(yǎng)，作為對照組。

1.2方法 兩組小鼠分別置于不同籠中，飼養(yǎng)室溫20～25℃，12/12 h正常晝夜交替，對照組飼料為：玉米40%，豆粉0%，糖5%，植物油5%，奶粉5%，面粉25%，麩皮20%；觀察組飼料為：豆粉40%，面粉25%，麩皮20%，植物油5%，奶粉5%，玉米0%，糖5%。喂養(yǎng)10 w后比較兩組小鼠體重、腫瘤發(fā)生率、潛伏期；取出未發(fā)生腫瘤的完整乳腺組織。

1.3觀察指標(biāo) 每周兩次觸摸小鼠乳腺，當(dāng)腫瘤直徑大于2 mm時便可檢測出，記錄摸到腫瘤的日期，計算腫瘤潛伏期，比較檢測出腫瘤直徑大于2 mm時，兩組小鼠體重并計算腫瘤發(fā)生率。取出未發(fā)生腫瘤乳腺組織后，采用放射免疫法測定未發(fā)生腫瘤的乳腺組織中睪酮(T)、雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)、泌乳素(PRL)的含量，分別按放射免疫檢測試劑盒說明進行測定。取出未發(fā)生腫瘤乳腺組織后，進行Whole mount染色，采取免疫組化技術(shù)觀察比較兩組小鼠未發(fā)生腫瘤的乳腺組織中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性表達(dá)率。其中ER及PR鼠抗人單克隆抗體、PCNA試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。按試劑盒說明書進行操作，采用已知陽性標(biāo)本切片和實驗切片分別進行陽性和陰性對照。ER、PR、PCNA陽性情況判斷：ER、PR、PCNA主要存在于細(xì)胞核，當(dāng)ER、PR陽性時表現(xiàn)為細(xì)胞核上有黃色或棕色的顆粒；陽性表達(dá)百分比(P)分為4個等級，等級1為0%，計0分，以后每個等級增加25%，分值加1；4等級為100%，計4分；陽性表達(dá)強度(I)分為3個等級，主要按照細(xì)胞染色顏色分級，1級為黃色；2級為棕黃色；3級為棕色。各基因表達(dá)水平分值(S)=P×I。S值≥3分即為陽性，其中最高分為12分，S值<3分為陰性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t和χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1觀察組、對照組小鼠體重、腫瘤潛伏期比較 觀察組進食量較小，活動量小，易腹瀉，與對照組相比體重減輕(P<0.01)；兩組腫瘤潛伏期近似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 觀察組、對照組小鼠體重、腫瘤潛伏期比較

2.2觀察組、對照組小鼠腫瘤發(fā)生率比較 觀察組、對照組共有42只小鼠出現(xiàn)腫瘤，腫瘤總發(fā)病率為52.5%；其中觀察組中有11只小鼠出現(xiàn)腫瘤，腫瘤發(fā)病率為27.5%；對照組中有31只小鼠出現(xiàn)腫瘤，腫瘤發(fā)病率為77.5%。觀察組腫瘤發(fā)生率明顯低于對照組(χ2=18.095 2，P=0.000 0)，表明大豆異黃酮能抑制轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤發(fā)生率。

2.3觀察組、對照組ER、PR、PCNA陽性率比較(%) 觀察組中ER呈陽性小鼠18例(45.0%)；對照組中ER呈陽性小鼠20例(50.0%)；兩者相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.050 1，P>0.822 8)。觀察組中PR呈陽性小鼠19例(47.5%)；對照組中PR呈陽性小鼠18例(45.0%)；兩者相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.050 3，P>0.822 6)。觀察組中PCNA呈陽性小鼠38例(95.0%)；觀察組中PR呈陽性小鼠15例(37.5%)；兩者相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.058 0，P<0.000 0)。

2.4觀察組、對照組各性激素含量對比 觀察組的E2、T、PRL水平顯著高于對照組(P<0.05)；觀察組的FSH和LH水平顯著低于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 觀察組、對照組各性激素含量對比

3 討 論

乳腺癌多發(fā)于女性人群，具有極高的致死率。臨床研究發(fā)現(xiàn)，c-erbB-2基因是乳腺癌病變的主要基因之一，該基因也被稱為Neu基因或HER-2基因，其受體的細(xì)胞胞內(nèi)具有較高的酪氨酸蛋白激酶活性，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、衰亡〔6〕。調(diào)查顯示，25%～45%的乳腺癌患者因該基因表達(dá)過多而發(fā)病，并且該種乳腺癌具有腫瘤進展快、惡性程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高、化療治療耐藥性高、生存率低等惡性特征〔7〕。目前，乳腺癌防治工作主要建立在早期飲食預(yù)防上，通過改善女性人群飲食習(xí)慣，增加植物雌激素等物質(zhì)攝入量可有效降低乳腺癌發(fā)病率。

GST是一種具有代表意義的植物雌激素，其是大豆生長過程中形成的一種次級代謝產(chǎn)物，該種代謝產(chǎn)物與雌性激素結(jié)構(gòu)相似〔8〕，可彌補人體雌性激素分泌水平，改善代謝生物學(xué)活性、生長因子活性、蛋白質(zhì)合成，是一種天然的乳腺癌等腫瘤疾病預(yù)防劑。GST發(fā)揮其類雌激素作用，上調(diào)小鼠乳腺組織內(nèi)E2水平，高水平E2和ER結(jié)合，通過誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)激活雌激素應(yīng)答元件；同時通過提高小鼠體內(nèi)雌激素效應(yīng)，產(chǎn)生反饋作用，抑制FSH和LH分泌，并促進PRL分泌〔9〕。

臨床研究證明，GST可作用人體基因表達(dá)，調(diào)節(jié)人體細(xì)胞凋亡過程進而影響多種腫瘤細(xì)胞生成。分析其作用機制可能與誘導(dǎo)DNA 的甲基化和影響雌激素受體途徑進而改善組蛋白的乙酰化過程有關(guān)〔10〕。此外，GST還可以抑制乳腺癌患者乳腺腫瘤細(xì)胞G2向M期轉(zhuǎn)變，同時誘導(dǎo)阻滯在該轉(zhuǎn)變周期內(nèi)衰亡〔11〕。臨床研究認(rèn)為，乳腺癌患者病發(fā)時患者體內(nèi)通常會被遺傳事件影響，而GST可上調(diào) mRNA對 BR-CAL基因的表達(dá)，進而抑制乳腺癌病變〔12〕。有學(xué)者研究認(rèn)為，當(dāng)人體雌性激素偏低時食用GST后，GST可與核內(nèi)ER結(jié)合，形成雌激素樣作用〔13〕。本次研究中選用ER、PR作為研究大豆異黃酮的參照數(shù)據(jù)，主要原因為：ER蛋白是一種2個分子質(zhì)量的激素結(jié)合蛋白分子形成的二聚體，而PR合成必然需要雌性激素啟動，也就是說一旦出現(xiàn)PR，ER就必然是活性的，檢測ER、PR可有效反映乳腺癌生成、進展和轉(zhuǎn)移情況。

4 參考文獻(xiàn)

1侯建峰,馮笑山.植物雌激素干預(yù)乳腺癌的研究進展〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志，2010；3(1):163-5.

2孫 晶,胡蓓蕾,鄔 偉,等.大豆異黃酮對β淀粉樣肽介導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷及海馬ChAT表達(dá)的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2010；27(12):135-7.

3全吉淑,程 靜,劉春彥,等.大豆異黃酮聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響〔J〕.營養(yǎng)學(xué)報，2011；33(5):112-4.

4侯建峰,馮笑山,楊曉鶴,等.轉(zhuǎn)基因雌鼠乳腺癌大豆異黃酮干預(yù)效果評價〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2010；26(10):125-7.

5溫海霞,孟 毅,龐海燕,等.大豆異黃酮對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化及SPARCmRNA表達(dá)的影響〔J〕.中國中醫(yī)藥科技,2012；19(1)：131-5.

6張廣平,蔡向前,侯建峰,等.大豆異黃酮在不同的雌激素環(huán)境下對MMTV-erbB-2轉(zhuǎn)基因小鼠的作用〔J〕.中華實驗外科雜志，2011；28(5):129-31.

7龐海燕,孟 毅,趙 薇,等.大豆異黃酮及主要活性成分Genistein對大鼠卵巢LRH-1基因表達(dá)的影響〔J〕.國際遺傳學(xué)雜志，2012；35(3):164-5.

8Nakoman C,Resmi H,Ay O.Effects of basic fibroblast factor (bFGF) on MMP-2，TIMP-2，and type-Ⅰ collagen levels in human lung carcinoma fibroblasts〔J〕.Biochimie，2005；87(3):186-8.

9周智君,俞遠(yuǎn)京,丁志剛,等.大豆異黃酮對老齡大鼠雌激素水平和子宮雌激素受體表達(dá)的影響〔J〕.中國實驗動物學(xué)報，2009；17(4)：288-91.

10蔡向前,張廣平,李小卉,等.大豆異黃酮在低雌激素環(huán)境下對MMTV-erbB-2轉(zhuǎn)基因小鼠的作用〔J〕.中華實用診斷與治療雜志，2011；25(9):147-8.

11Lee MS,Jung JI,Kwon SH.TIMP-2 fusion protein with human serum albumin potentiates anti-angiogenesis-mediated inhibition of tumor growth by suppressing MMP-2 expression〔J〕.Plos One，2012；7(4):168-71.

12Vasala K,Turpeenniemi-Hujanen T.Serum tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2)and matrix metalloproteinase-2 in complex with the inhibitor (MMP-2:TIMP-2) as prognostic markers in bladder cancer〔J〕.Clini Biochem，2007；40(9-10):640-4.

13甘 萍,李艾珊,聶桂麗,等.多西環(huán)素對乳腺癌移植瘤小鼠MMP-2及TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010；30(2):162-5.