牟衛(wèi)平 蘇世輝 曹 璋

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濱州 256603)

胃癌患者的預(yù)后與一些臨床和病理指標(biāo)相關(guān)，主要包括腫瘤分期、組織類(lèi)型、分化程度以及治療方法等。惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子表達(dá)異常，其與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后更為密切；其中最為重要的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β〔1〕。TGFβ是一個(gè)大的蛋白家族中的成員，包括結(jié)構(gòu)和功能相似的3個(gè)成員：TGFβ1、β2和β3〔2〕。體外試驗(yàn)中這三個(gè)分子能夠通過(guò)抑制cyclin-依賴(lài)性激酶誘導(dǎo)正常細(xì)胞和一些惡性轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯。TGFβ還可以通過(guò)失活突變、其相應(yīng)受體的下調(diào)或TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的元件突變起到生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。試驗(yàn)表明在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)TGFβ1過(guò)表達(dá)〔3〕，在正常細(xì)胞中不表達(dá)TGFβ1蛋白和mRNA，還有研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者TGFβ1的表達(dá)水平與腫瘤分期，預(yù)后效果有關(guān)，并且可以作為獨(dú)立預(yù)后因素〔4〕。本研究觀察TGFβ表達(dá)與其他典型預(yù)后影響因素和存活率的相關(guān)性。

1 研究對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 我院2005年6月到2008年6月胃癌手術(shù)患者110例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病例的存檔組織，病理記錄數(shù)據(jù)和臨床隨訪數(shù)據(jù)齊全。手術(shù)前沒(méi)有接受過(guò)化療和放療，手術(shù)方法包括全胃或部分胃切除，胃切除范圍依腫瘤位置而定。術(shù)后病理分級(jí)為以下幾類(lèi)：R0切除(67例)，手術(shù)完全切除了腫瘤，在術(shù)后組織病理學(xué)檢驗(yàn)邊緣組織中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有腫瘤微轉(zhuǎn)移跡象， R1切除(31例)：手術(shù)中腫瘤完全切除，但在組織病理學(xué)檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)邊緣仍有微腫瘤灶殘余。R2切除(12例，病情緩解)：在手術(shù)切除的大體標(biāo)本和病理鏡檢腫瘤在切除邊緣都有殘留。排除標(biāo)準(zhǔn)為：患者有其他重要器官的功能不全，有嚴(yán)重的感染，術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥(出血、吻合口瘺及胰瘺等)或者合并有其他部位的惡性腫瘤及切除時(shí)腫瘤已有廣泛的腹腔轉(zhuǎn)移。男71例，女39例，年齡25～72(中位數(shù)56)歲。見(jiàn)表1。隨訪期內(nèi)76.2%(84/110)的病例存活。

表1 TGFβ1、β2和β3表達(dá)水平與不同病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

1.2研究方法 該試驗(yàn)為盲法，病理醫(yī)生在觀察病理切除時(shí)并不了解相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。有專(zhuān)人詳細(xì)記錄病理，進(jìn)行檢查，驗(yàn)證病理等級(jí)以及腫瘤分期。試驗(yàn)中所有腫瘤均根據(jù)惡性腫瘤國(guó)際腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)(TNM)進(jìn)行分期，其中中等或分化良好的腸道腺癌(根據(jù)Lauren分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn))為低惡度腫瘤，而分化不佳的腸道腫瘤以及有擴(kuò)散腺癌是高惡度腫瘤。術(shù)后隨訪3～42(中位數(shù)17)個(gè)月，觀察患者的生存率。

1.3免疫組化 將手術(shù)切除后的胃癌組織和正常非癌胃組織制作成4 μm厚的石蠟切片，進(jìn)行免疫組化，檢測(cè)TGFβ1、β2和β3蛋白表達(dá)水平。對(duì)Ⅲ和Ⅳ期腫瘤患者還要對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行檢測(cè)，記錄原發(fā)位點(diǎn)和轉(zhuǎn)移病灶內(nèi)的3種TGFβ表達(dá)水平的差異。將石蠟切片放在覆膠玻片上，使用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。使用1%過(guò)氧化氫處理15 min阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶。將玻片放在微波爐中高火處理5 min，重復(fù)兩次，進(jìn)行抗原修復(fù)。使用標(biāo)準(zhǔn)抗生物素蛋白-生物素檢測(cè)技術(shù)(Multilinkkit;Biogenex,SanRamon,CA)檢測(cè)抗原。使用的抗體包括有抗TGFβ1、β2和β3的兔源多抗(均按1∶100稀釋?zhuān)籗anta Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz,CA)。使用二氨基聯(lián)苯(Sigma Fast DAB tablets, D-4293,St. Louis, MO)作為顯色劑。使用Harris蘇木素進(jìn)行復(fù)染。所有步驟均在室溫下進(jìn)行。每步之間均要用PBS漂洗。使用小鼠卵巢切片(Santa Cruz,CA)作為T(mén)GFβ1的陽(yáng)性對(duì)照，使用人胎盤(pán)組織作為T(mén)GFβ2的陽(yáng)性對(duì)照，使用Paget患者的乳房組織作為的陽(yáng)性對(duì)照。試驗(yàn)使用正常兔血清代替一抗作為陰性對(duì)照。TGFβ1、β2和β3胞質(zhì)著色則認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)。標(biāo)本中5%以上的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)TGFβ1、β2和β3的胞質(zhì)著色則認(rèn)為病例為陽(yáng)性。

1.4形態(tài)學(xué)分析 在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片進(jìn)行掃描，選擇陽(yáng)性染色區(qū)域。使用10×10顯微鏡網(wǎng)格在400×放大倍數(shù)下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。在選中區(qū)域計(jì)數(shù)免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)(至少500個(gè)細(xì)胞)，每張切片要選擇5個(gè)不同的區(qū)域計(jì)數(shù)。每個(gè)區(qū)域腫瘤和非腫瘤胃組織中TGFβ1、β2和β3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)得到陽(yáng)性細(xì)胞百分比。同一區(qū)域數(shù)值大于10%，數(shù)值沒(méi)有差異。然后計(jì)算平均得分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用單變量方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間比較，評(píng)估病理學(xué)參數(shù)與染色結(jié)果之間的關(guān)系。如果不符合變量的方差相等或變量不呈正態(tài)分布，則使用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。使用Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)TGFβ1、β2和β3之間的關(guān)系及 TGFβ2表達(dá)水平與患者存活時(shí)間之間的關(guān)系。使用Kaplan-Meier方法比較生存曲線。后者包括生存率和無(wú)病生存率。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS10.0。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本免疫組化染色的TGFβ1、β2和β3表達(dá) TGFβ1主要在癌細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)。有78例病例腫瘤中有TGFβ1的表達(dá)，而正常黏膜和上皮細(xì)胞沒(méi)有TGFβ1的表達(dá)。癌細(xì)胞中TGFβ2的表達(dá)水平明顯高于正常上皮細(xì)胞(P<0.01)，并且與腫瘤位置，分期和等級(jí)無(wú)關(guān)。正常黏膜和癌細(xì)胞中均有TGFβ3的表達(dá)。正常黏膜和癌細(xì)胞中TGFβ3的表達(dá)水平之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。所有腫瘤中均有TGFβ2和β3表達(dá)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中均可檢出TGFβ1、β2和β3的表達(dá)。晚期腫瘤TGFβ2的表達(dá)水平更高(P=0.008)。但TGFβ1和β3并未顯示出這種變化趨勢(shì)。低惡度腫瘤中的TGFβ1表達(dá)水平更高(P=0.009)。見(jiàn)表1，圖1。腫瘤等級(jí)、位置與TGFβ2和β3的表達(dá)水平無(wú)關(guān)， Ⅲ期腫瘤患者TGFβ2和β3的表達(dá)水平之間存在直接關(guān)系(r= 0.610；P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.2TGFβ1、β2和β3表達(dá)水平和臨床治療結(jié)果之間的關(guān)系 TGFβ1的表達(dá)能提高患者的無(wú)病存活率(圖3；P<0.05)和總體存活率(圖4；P<0.05)。相反，TGFβ2的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致患者的存活率下降(r=0.239，P=0.011；圖5)。而TGFβ3表達(dá)水平則和患者的存活率以及無(wú)病存活時(shí)間之間沒(méi)有關(guān)系。影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素主要有腫瘤分期和等級(jí)，樣本中淋巴結(jié)數(shù)量，切除范圍(R0，R1，R2)，只有TGFβ1可以作為獨(dú)立預(yù)后因素(表2)。

TGFβ1(×400) TGFβ2(×200) TGFβ3(×400)

圖2 TGFβ2和TGFβ3表達(dá)的關(guān)系

圖3 TGFβ1表達(dá)與無(wú)病存活率間的關(guān)系

圖4 TGFβ1表達(dá)與總存活率間的關(guān)系

圖5 TGFβ2表達(dá)與存活時(shí)間的相關(guān)性

3 討 論

TGFp是一類(lèi)多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子，對(duì)細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、血管的生成、細(xì)胞凋亡及機(jī)體免疫系統(tǒng)均起著重要的調(diào)節(jié)作用。在哺乳動(dòng)物TGF-p有3種:TGFβ1、β2、β3，分別由不同的基因編碼〔5〕，具有組織特異性，TGFp信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生障礙，引起包括自身免疫疾病、腫瘤等許多疾病。最近的一些試驗(yàn)主要觀察了胃癌中TGFβ1的表達(dá)，結(jié)果都提示胃癌中TGFβ1 mRNA的表達(dá)可能與早期胃癌的預(yù)后有關(guān)，在病理標(biāo)本中淋巴結(jié)為陰性〔6〕，無(wú)腫瘤周?chē)窠?jīng)束及外膜侵犯的早期胃癌患者腫瘤細(xì)胞中的TGFβ1 mRNA的表達(dá)提高。這些結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明低惡度腫瘤中TGFβ1表達(dá)水平更高,預(yù)后更好。另外，Zhou等〔7〕發(fā)現(xiàn)TGFβ1(+)腫瘤患者5年存活率為55.9%，而TGFβ1(-)腫瘤患者5年存活率為67%，說(shuō)明TGFβ1表達(dá)會(huì)改善預(yù)后。Ma等〔8〕指出TGFβ1表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，并且可以作為獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，同時(shí)組織活檢樣本中TGFβ1 mRNA的水平與患者治療結(jié)果有關(guān)，并且可能作為一種新的預(yù)后工具。Ma等〔8〕的結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致，都說(shuō)明TGFβ1表達(dá)水平可以作為一種獨(dú)立預(yù)后因素。TGFβ1在參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，這與其在其他惡性腫瘤中的表達(dá)模式相似，尤其是與結(jié)直腸癌中TGFβ1的表達(dá)模式尤為一致。由于TGFβ1特異在癌細(xì)胞中活躍合成，因此其參與胃癌的形成〔9〕。低惡度腫瘤中TGFβ1的表達(dá)水平高于高惡度的腫瘤。其機(jī)制可能與腫瘤TGF-1表達(dá)減少時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不能停留在G1期，細(xì)胞分裂增殖失去控制〔10〕，類(lèi)上皮樣生長(zhǎng)因子表達(dá)上調(diào)，黏膜上皮惡性程度增加有關(guān)。因此推測(cè)在高惡度胃癌(分化不良的腸道腫瘤或有明顯擴(kuò)散腫瘤)中，還可以有其他機(jī)制參與。本研究說(shuō)明TGFβ2是在腫瘤發(fā)展過(guò)程中產(chǎn)生的,而非其始動(dòng)因素。TGFβ3的表達(dá)與腫瘤分期和等級(jí)之間無(wú)關(guān)。推測(cè)TGFβ3可能不參與腫瘤形成。

先前試驗(yàn)提示TGFβ1基因敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)多位點(diǎn)炎癥疾病〔10〕，這就表明TGFβ1在抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)中起重要作用。另一方面，TGFβ3/小鼠出現(xiàn)輕度表皮細(xì)胞分化缺陷，表現(xiàn)為腭片融合形成唇腭裂。其中TGFβ2缺失的表型最為嚴(yán)重，會(huì)導(dǎo)致多種發(fā)育缺陷。這些現(xiàn)象提示這3種分子(TGFβ1、β2和β3)在正常發(fā)育過(guò)程中起到了不同的作用〔11〕，并且這些分子在腫瘤發(fā)生過(guò)程中也有不同的作用。這也解釋了3種分子在腫瘤和正常胃黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)模式的差異及TGFβ1和β2與患者存活率之間的關(guān)系的差異。TGFβ1表達(dá)作為獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，并且在TGFβ1表達(dá)缺陷會(huì)導(dǎo)致腫瘤惡性程度提高，這就提示低惡性度胃癌的靶向增加TGFβ1的表達(dá)可能是一種有效的輔助治療手段或者是化療保護(hù)策略〔12〕。

總之，胃癌組織中TGFβ 3種異構(gòu)體存在表達(dá)差異，這種差異反映在惡性腫瘤表型和患者存活率上。仍需進(jìn)一步研究確定這些分子的表達(dá)與胃癌進(jìn)程之間的關(guān)系。

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