買尼沙·買買提 劉冬青 孟憲明 葉 玨 張燕婉 程祖亨 帕提曼·買買提 牙合甫江 高方明 帕爾哈提 楊躍進

(新疆醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院心臟中心，新疆 烏魯木齊 830011)

炎癥反應是急性冠狀動脈綜合征(ACS)斑塊易損的關鍵因素〔1，2〕。CD40-CD40L系統(tǒng)作為免疫和炎癥反應的樞紐，幾乎貫穿ACS全過程，對斑塊的破裂起著關鍵作用，可能刺激血管內皮細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞產(chǎn)生與動脈粥樣硬化(AS)有關的生物活性因子，如選擇素、細胞因子等，參與AS斑塊形成及破裂〔3〕。目前認為CD40L是各種免疫炎癥反應調節(jié)的信號通路，參與AS斑塊內主要細胞成分的炎癥反應調節(jié)〔4，5〕。流行病學研究表明，遺傳基因在冠心病發(fā)病中可能起重要作用，但引起冠心病的分子機制迄今仍不明確。目前CD40L基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與ACS的相關性研究剛起步，國內外關于CD40-CD40L多態(tài)性檢測的相關報道大多采用聚合酶鏈反應(PCR)-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析方法〔5〕，更未見在維吾爾族與漢族之間對比研究。

1 對象與方法

1.1對象 380例研究對象，110例維吾爾族患者來自2009年1至2010年1月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院、喀什地區(qū)人民醫(yī)院、喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院接受冠狀動脈介入治療的ACS住院患者；40例同時期進行冠狀動脈造影檢查的患者為維吾爾族穩(wěn)定型心絞痛(SAP)組，40例體檢正常的維吾爾族人為正常對照組。110例漢族患者來自同時期在北京阜外心血管病醫(yī)院接受冠狀動脈介入治療的ACS住院患者；設立40例同時期進行冠狀動脈造影檢查的患者為漢族SAP組；40例體檢正常的漢族人為正常對照組。正常對照組排除心臟病變和器質性疾病，并排除急性感染、創(chuàng)傷或手術2 w以內者、合并腦血管意外或外周血管疾病、肝、腎功能不全、惡性腫瘤、慢性結締組織病。

采集受試對象的臨床資料，主要包括臨床表現(xiàn)、體質量指數(shù)(BMI)、高血壓病史、吸煙史、糖尿病史、血脂異常、腦血管病、冠心病及周圍血管病、用藥史和家族史等以及體格檢查、實驗室檢測、心電圖、超聲心動圖檢查。血壓測定采用經(jīng)矯正的汞柱式血壓計，在采血前測量，測量前靜坐 5 min，禁止吸煙。測坐位右上臂血壓，重復測 2 次，取平均值等。測定空腹血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等生化指標。

納入標準：①符合ISFC/WHO公布的冠心病診斷標準并經(jīng)冠狀動脈造影證實；②知情同意。研究采用標準：ACS的診斷采用2004 年《美國ST 段抬高心肌梗死診斷及治療指南》〔6〕的標準，2007 年《美國不穩(wěn)定心絞痛及非 ST 段抬高心肌梗死診斷及治療指南》〔7〕的標準；血脂異常的診斷采用我國 2007 年的《中國成人血脂異常防治指南》〔8〕的標準；高血壓的診斷采用 2004 年《中國高血壓防治指南(實用本)》〔9〕；糖尿病的診斷采用我國 2007年的《中國糖尿病防治指南》〔10〕；BMI 分級標準采用我國 2004 年中國肥胖問題工作組的建議〔11〕。排除標準：心肌炎、心肌病、心內膜炎、風濕性心臟病等心臟疾??；自身免疫?。荒[瘤；肝硬化及其他重要臟器病變；1個月內有感染、使用抗炎藥物及近期手術者；各組ACS患者與非ACS患者年齡、性別構成比、左室射血分數(shù)、高血壓、糖尿病無顯著差異。

1.2儀器與材料 主要儀器：冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、臺式低速、高速離心機、電熱恒溫水浴箱、7300型實時熒光定量PCR儀、微量移液器、紫外分光光度儀等。試劑：檢測血CD40L的ELISA試劑盒(美國R&DSystems公司)、CD40L檢測位點的TaqMan 探針；CD40L SNP基因分型試劑(SNP Genotyping Assay Mix)；CD40L用TaqMan 通用 PCR 擴增預混試劑(TaqMan Universal PCR Master Mix)；MicroAmp 光學96孔反應板(MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate)等均由美國應用生物系統(tǒng)公司提供。人類基因組DNA提取外周靜脈血5 ml，采用鹽析法提取人白細胞基因組DNA。

1.3檢測方法 (1)使用專用抗凝管空腹采血，血樣本在室溫下以3 000 r/min離心15 min，提取上層血清分裝于不同試管中，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)錂z。用ELISA法檢測sCD40L。ELISA試劑盒由美國R&DSystems公司提供。所有操作均按說明書完成。(2)使用美國ABI公司提供的7300實時熒光PCR儀檢測CD40L-3459A>G位點SNP。PCR反應體系成分為dH2O體積為256.25 μl；2× TaqMan Universal PCR Master Mix為375 μl；DNA為100 μl；40×SNP Genotyping Assay Mix(CD40L)為18.75 μl；PCR擴增高聚：95℃ 10 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min共40個循環(huán)。

1.4冠狀動脈狹窄程度的計算 由心臟內科專業(yè)醫(yī)師進行冠狀動脈造影，入路途徑為經(jīng)股動脈或經(jīng)橈動脈途徑。左冠狀動脈至少投照四個體位，右冠狀動脈至少投照兩個體位，必要時加其他體位至冠狀動脈各段能夠充分顯示。采用美國冠狀動脈手術研究(CASS)診斷標準和Gensini評分標準〔12〕，狹窄≤25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為4分，75%～90%為8分，90%～99%為16分，100%(閉塞)為32分。不同節(jié)段冠狀動脈評分系數(shù)按Gensini標準，每例患者冠狀動脈病變程度的最終積分為各分支積分之和。冠脈狹窄的嚴重性按Gensini評分評估。狹窄程度評分再乘以相應系數(shù)后得出最終分數(shù)。

2 結 果

2.1一般資料比較 無論是維吾爾族還是漢族，對照組與ACS組在性別、年齡和左室射血分數(shù)兩組無顯著差別(P>0.05)。ACS組BMI高于對照組。ACS組中吸煙并伴有高血壓病、糖尿病和/或高膽固醇血癥的比例顯著高于對照組。維吾爾族和漢族一般臨床資料比較，兩民族間未見顯著性差異。無論是漢族還是維吾爾族，預防性服用他汀類及對氨基水楊酸類藥物的意識低。見表1。

表1 維、漢各組研究對象一般臨床資料

2.2維吾爾族及漢族ACS組與對照組 CD40L 基因-3459A>G多態(tài)性基因型及等位基因頻率的比較 本研究SNP位點在各組中分別均符合Hardy-Weinberg平衡。-3459A>G基因型、-3459G等位基因在漢族健康對照者和ACS患者之間差異有顯著性(P<0.05)；-3459A>G基因型和-3459G等位基因在維吾爾族健康對照組和ACS組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 維吾爾族、漢族ACS組與對照組 CD40L 基因-3459A>G SNP位點基因型分布和等位基因頻率

2.3CD40L SNP位點與冠狀動脈AS病變支數(shù)之間的關系 無論是維吾爾族還是漢族冠心病患者，不同基因型間冠狀動脈病變支數(shù)存在顯著性差異(P<0.05)。漢族、維吾爾族均是 GG 基因型與冠狀動脈病變支數(shù)有顯著相關性。見表3。

表3 維吾爾族、漢族ACS、SAP、對照組患者冠狀動脈病變支數(shù)與-3459A>G SNP的相關性

2.4CD40L SNP位點與冠狀動脈AS病變之間的關系 -3459A>G多態(tài)性位點中CD40LG基因在不同冠狀動脈病變評分數(shù)組其少見等位基因頻率及基因型頻率差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著評分的增加，CD40LG基因的出現(xiàn)頻率也增加，也就是說維吾爾族、漢族ACS患者CD40LG基因與冠脈病變的嚴重程度具有相關性。見表4。

表4 維吾爾族、漢族ACS、SAP患者冠狀動脈病變Gensini評分與CD40L-3459A>G SNP的相關性

2.5CD40L基因多態(tài)性及血sCD40L 水平對冠狀動脈病變程度的影響 不論是維吾爾族還是漢族ACS患者不同基因型間血sCD40L水平與冠狀動脈評分存在顯著性差異(P<0.05)。不論是維吾爾族還是漢族ACS患者，均以 GG 基因型的 sCD40L 水平最高，冠狀動脈病變程度最嚴重將維吾爾族及漢族人群以冠狀動脈病變積分分為：高分組與低分組；與血清sCD40L 水平以三位數(shù)為界分為sCD40L高值組和sCD40L低值組，結果顯示，在校正了高TC、高血壓、高尿酸、糖尿病和吸煙等危險因素后，血清 sCD40L水平與CD40L G 基因多態(tài)性以及冠狀動脈病變程度顯著相關。見表5。

表5 CD40L A>G 基因 SNP及血清 sCD40L 水平與ACS患者冠狀動脈病變程度的相關性

2.6維吾爾族、漢族患者ACS危險的多因素分析 結果見表6。以性別(男=1，女=0)，年齡(≥60歲=1，<60歲=0)、高血壓(有=1，無=0)、糖尿病(有=1，無=0)、BMI(>25=1，≤25=0)、CD40L-3459A>G等位基因(AG、GG=l，AA=0)作為自變量(X)，血脂等指標分為不同的等級：TC(<5.2 mmol/L =0，5.2～5.7 mmol/L=1，≥5.7 mmol/L=2)、TG(≤1.7 mmol/L=0，1.8～2.3 mmol/L=1，≥mmol/L=2)、HDL(<0.90 mmol /L=0，0.9～1.03 mmol/L=1，≥1.03 mmol/L=2)、LDL-C(<3.1 mmol/L=0，3.1～3.6 mmol/L=1，≥3.6 mmol/L=2)；LP(a)(<30=1，≥30=2)；CRP(<1.1 mg/L=0，1.0～3.0 mg/L=1，≥3.0 mg/L=2)；IL-6(<20 pg/ml=0,≥20 pg/ml=1)；sCD40L(<2.9 ng/ml=0, ≥2.9 ng/ml=1)作為自變量(X)，將是否患有ACS作為應變量Y(患病=1，未患病=0)。結果顯示，TC、lp(a)、年齡、TG、性別、高血壓、糖尿病、sCD40L、IL-6是本研究對象ACS發(fā)生的獨立的危險因素。不論維吾爾族還是漢族ACS患者，Logistic 回歸校正性別、年齡、MBI、高血壓病、糖尿病、高TC血癥及吸煙等冠心病易患因素后，CD40L G基因多態(tài)性是冠心病發(fā)病的獨立的危險因素(P<0.05)。

表6 維吾爾族、漢族急性冠脈綜合征的Logistic回歸分析結果

3 討 論

CD40/CD40L是一對互補跨膜糖蛋白，是免疫和炎癥反應中重要的信號轉導途徑。CD40L也稱CD154，是腫瘤壞死因子超家族的成員之一，基因定位于Xq26.3～q27.1區(qū)，跨度大約13 kb，包含5個外顯子和4個內含子。血小板活化時，儲存在 α 顆粒內的CD40L 可以很快移行到血小板表面，脫落成為可溶的CD40L(sCD40L)〔12，13〕。無論是膜結合形式還是sCD40L，都能與CD40 結合，啟動相應的免疫、炎癥反應〔14〕。斑塊的肩部是炎癥的好發(fā)部位，炎癥反應貫穿于AS從脂紋的形成到斑塊、斑塊破裂和血栓形成的全過程，在一定程度上決定著AS斑塊的穩(wěn)定性和自然進程。體外研究〔15〕已證實CD40L可刺激血管內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞表達和釋放基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-9等一系列蛋白酶，通過激活MMPs從而促進斑塊易于破裂，同時刺激促炎因子，如白細胞介素(IL)-1a，IL-10，IL-6、γ-干擾素(IFN-γ)等大量釋放〔16〕，激活細胞的凋亡、損壞內皮細胞，引起激烈的炎癥反應，進而CD40/CD40L與炎癥反應之間形成惡性循環(huán)，導致易損斑塊的破裂。國外M?larstig等〔17〕在北歐人群2 359例非ST段抬高的ACS病人中進行隨機對照的前瞻性研究報道(對CD40L的6個SNP位點進行了檢測)CD40L-3459 A﹤G SNP決定血漿CD40L的水平，增加細胞表面CD40L的表達，而且增大與CD40間的相互作用，預示心肌梗死。CD40-CD40L與斑塊的不穩(wěn)定及ACS粥樣斑塊主要由血管平滑肌和炎癥細胞以及細胞外基質所組成，可分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊。CD40及CD40L主要分布在斑塊的“肩部”，即斑塊與正常組織的交界處，能刺激粥樣斑塊相關細胞表達和產(chǎn)生一系列與斑塊破裂和血栓形成有關的活性物質。

研究表明〔18〕，AS同樣與遺傳因素密切相關?，F(xiàn)在普遍認為AS是一種多基因疾病，SNP是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)性，是導致人體許多表型差異、對藥物反應或疾病的易感性差異的重要原因之一。目前已鑒定的與疾病易感性有關的功能性SNP多定位于蛋白質編碼區(qū)，功能性SNP主要通過改變蛋白質的氨基酸序列(如編碼區(qū)的SNP)或在轉錄水平導致mRNA表達發(fā)生變化(如位于基因調控序列內的SNP)而發(fā)揮作用〔19〕。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)，編碼合成人類CD40/CD40L的基因也存在SNP，這些SNP與包括AS在內的一系列自身免疫性疾病和心血管疾病的易感性相關〔5〕。Jacobson 等〔20〕認為CD40 基因 Kozak 序列多態(tài)性可提高 CD40 翻譯效率，從而影響 CD40 水平。還有文獻〔21〕報道CD40-E1SNP(-1C/T)正位于Kozak序列，C 等位基因可提高 CD40 的翻譯效率。國外文獻〔17〕報道，CD40L G基因是瑞典人群預測急性心肌梗死的易感基因，且與sCD40L升高有相關性。本研究并未發(fā)現(xiàn)A等位基因與ACS的相關性。本研究中 G 等位基因型顯著增高血清sCD40L 水平，G 等位基因攜帶者冠狀動脈病變程度也較嚴重。

隨著評分的增加，CD40LG基因的出現(xiàn)頻率也增加，即維吾爾族、漢族ACS患者CD40LG基因與冠脈病變的嚴重程度具有相關性。CD40LG 等位基因與維吾爾族與漢族ACS可能相關?？赡苁沁@兩民族ACS的易感因子是冠脈粥樣斑塊糜爛或破裂的易感因子，而與冠脈病變程度有一定的相關性。CD40LG 等位基因可能與維吾爾族和漢民族ACS性CD40L高表達有相關性。在研究中，雖然對入選研究對象的性別和年齡進行了匹配，但仍有其他潛在的混雜因素未能很好地控制；本研究存在入選人群的種族、地區(qū)差異等局限性，因此尚不能提供全面充分的證據(jù)來證實維吾爾族、漢族CD40L-3459A>G多態(tài)性與ACS發(fā)病的確切關系。期待將來能有大樣本、多中心、前瞻性的研究，并在多地域、多種族人群中進行群體遺傳學的復制試驗，進一步揭示基因多態(tài)性與疾病的關系。

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