馬 雷 高英英 辛 華 王光彥

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

近年來，前列腺癌(PCa)已成為危害中國男性健康的主要疾病之一〔1〕。前列腺特異性抗原(PSA)作為PCa的篩查、診斷、治療、監(jiān)測和良性前列腺疾病的鑒別診斷的主要指標〔2〕已被廣泛推廣使用。正常情況下，PSA被排泌到前列腺導(dǎo)管內(nèi)，成為精液的一部分，只有很少量進入血液中。但是在前列腺的惡性腫瘤、前列腺增生(BPH)和前列腺炎癥時PSA都可以明顯升高。PCa和BPH患者外周血PSA值的重疊交叉造成了不必要的前列腺活檢〔3〕。實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)一直以來PSA mRNA的測定都處于定性和半定量的水平，而RT-PCR技術(shù)則達到了完全定量水平。本文應(yīng)用RT-PCR技術(shù)測定PCa、BPH伴炎癥和不伴炎癥患者前列腺組織中的PSA mRNA含量，以期研究分析外周血PSA水平和良惡性疾病前列腺組織生成PSA能力的關(guān)系，旨在探討良性BPH伴炎癥和不伴炎癥患者前列腺組織PSA mRNA水平和外周血PSA含量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料 選自2007～2011年佳木斯大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科住院病人。PCa組22例，由于外周血PSA值升高、前列腺彩超、CT、MRI結(jié)果異常，初診為可疑PCa，后經(jīng)前列腺穿刺活檢，病理確診為PCa，年齡60～87〔平均(70±9.7)〕歲。BPH組38例，由于排尿困難就診，經(jīng)前列腺彩超、CT、MRI檢查診斷為BPH。需要做經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)(TURP)治療入院，病理確診為BPH，年齡48～87〔平均(67±8.7)〕歲。

所有病例均進行全部入院檢查，包括肛門指診、外周血PSA、f-PSA、彩超、CT和MRI檢查。留取前列腺穿刺活檢標本和TURP切除組織，置入凍存管中，保存在液氮罐中，并盡快保存在-80℃超低溫冰箱中。

1.2儀器及材料 總RNA提取RNAiso試劑盒、白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶、溴乙啶、焦碳酸二乙酯(DEPC)購自寶生物工程(大連)有限公司，引物由上海生物工程服務(wù)技術(shù)有限公司合成RT-PCR試劑盒：中山大學達安基因股份有限公司。PSA、f-PSA試劑盒：羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。RT-PCR 分析儀：Applied Biosystems 7300 RT-PCR system。外周血PSA、f-PSA分析儀器(電化學發(fā)光法)：HITACHI Elecsys 2010。

1.3外周血的提取 采血前避免影響PSA和f-PSA的因素，保證結(jié)果的準確性，抽取空腹靜脈血(各項檢查前)5 ml，立即2 000 r/min離心10 min，分離外周血置-20℃保存，1 w內(nèi)完成實驗。

1.4引物序列 PCR引物：上游：5′-CACTGCATCAGGAACAAAA-3′，下游：5′-CTCATATCGTAGAGCGGGT-3′。β-actin 上游：5′-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游：5′-GAACTTTGGGGGATGCTCGC-3′，擴增目的片段長度為712 bp。

1.5前列腺組織總RNA提取

1.5.1防止RNA分解酶的破壞和污染 實驗中使用的一次性塑料制品均購買經(jīng)0.1%DEPC水處理過的RNA實驗專用器材。所有試劑、器械和三蒸水都經(jīng)0.1%DEPC水隔夜處理，又經(jīng)過120℃ 60 min高溫高壓處理。實驗過程中避免交談，防止唾液中的RNA分解酶破壞RNA。

1.5.2總RNA的提取 嚴格按照RNAiso試劑盒中的操作程序進行。組織研磨時要徹底，以無可見的明顯顆粒為準，充分的研磨可以保證RNA的提取率和質(zhì)量。RNAiso reagent與組織塊的比例為1∶1。氯仿乳化時一定要充分，直到無分相現(xiàn)象。RNA 沉淀清洗時盡量除凈乙醇，減少RNA 中的鹽離子含量，并要求室溫干燥，不能加熱干燥。RNA 沉淀完全溶解于DEPC處理水中后，于-80℃保存。

1.6總RNA質(zhì)量鑒定 用1.2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。RNA純度和濃度用紫外分光光度計下測OD260、OD280值。取OD260/OD280值在1.8～2.0范圍內(nèi)的標本進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.7cDNA合成 反應(yīng)體系為總RNA 2 μl，MgCl23 μl，10×RT緩沖液2 μl，RNase Free dH2O 9.5 μl，dNTP混合液1 μl，RNase抑制劑0.5 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，Oligo dT-Adaptor Primer 1 μl；反應(yīng)條件為：30℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。cDNA保存于-20℃冰箱待用。

1.8實時PCR 反應(yīng)體系為：TaqDNA聚合酶 0.5 μl，MgCl24 μ1，5×PCR緩沖液 5 μ1，dNTP 4 μl，PSA上、下游引物各2 μl，cDNA 5 μ1，滅菌蒸餾水 27.5 μl；溶解曲線出現(xiàn)單一波峰說明擴增產(chǎn)物單一，無非特異性擴增產(chǎn)物。反應(yīng)條件：孵育：94℃ 120 s，循環(huán)1次；擴增：94℃ 25 s,65℃ 30 s,72℃ 30s，45個循環(huán)，延伸階段結(jié)束時收集熒光信號；溶解曲線：65℃ 1 s,94℃ 20 s,循環(huán)1次，在溫度緩慢升高過程中收集熒光信號。

1.9外周血PSA的檢測 PSA定量檢測采用電化學發(fā)光法，使用儀器為HITACHI Elecsys 2010，由專業(yè)工作人員測定。

2 結(jié) 果

2.1BPH組、PCa組檢測結(jié)果比較 血PSA濃度在BPH組〔(5.831±6.753)ng/ml〕和PCa組〔(98.232±129.124)ng/ml〕比較差異顯著(P<0.01)，組織PSA mRNA表達量在BPH組〔(59.845±132.017)拷貝數(shù)〕和PCa組〔(20.23±28.223)拷貝數(shù)〕比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.2無炎癥BPH組與合并炎癥BPH組檢測結(jié)果比較 血PSA濃度在無炎癥BPH組〔(6.234±7.814)ng/ml〕和合并炎癥BPH組〔(6.929±5.477)ng/ml〕比較無顯著性差異(P>0.05)。組織PSA mRNA表達量在無炎癥BPH組〔(59.231±123.458)拷貝數(shù)〕和合并炎癥BPH組〔(74.866±148.258)拷貝數(shù)〕比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.3PCa組外周血PSA和組織PSA mRNA定量結(jié)果和臨床參數(shù)的關(guān)系 PCa組外周血PSA在3種年齡分組中總體比較無顯著性差異(P>0.05)；在3種臨床分期中總體比較差異顯著(P<0.05)；在3種Gleason評分中總體比較無顯著性差異(P>0.05)。PCa組組織PSA mRNA定量檢測在3種年齡分組中總體比較無顯著性差異(P>0.05)；在3種臨床分期中總體比較無顯著性差異(P<0.05)，臨床分期B期和C、D兩期組間比較差異顯著(P<0.05)；在3種Gleason評分中總體比較無顯著性差異(P>0.05)，Gleason評分8～10分組和5～6分組、5～7分組兩組組間比較差異顯著(P<0.01)，見表1。

表1 PCa組外周血PSA和組織PSAmRNA定量結(jié)果和臨床參數(shù)的關(guān)系

2.4三種疾病分組組織PSA mRNA表達量和外周血PSA水平的相關(guān)性分析 無炎癥BPH組前列腺組織PSA mRNA表達量和外周血PSA水平具有相關(guān)性(r=0.614，P=0.001) 。合并炎癥BPH組前列腺組織PSA mRNA表達量與外周血PSA值無相關(guān)性(r=0.295,P=0.324)。PCa組組織PSA mRNA表達量與外周血PSA值無相關(guān)性(r=0.325,P=0.457)。

3 討 論

對于前列腺，外周血PSA指標十分特異，現(xiàn)已成為前列腺疾病尤其是PCa的主要標志物〔4,5〕。大部分PCa病人的外周血PSA會出現(xiàn)明顯的增高，可是在不同發(fā)病原理的誘導(dǎo)下，前列腺炎和BPH病人同樣會出現(xiàn)外周血PSA不同程度的升高。這樣良、惡性前列腺疾病的外周血PSA水平出現(xiàn)了一定的重疊，使得PSA作為惡性前列腺疾病的標志物的用途受到了影響。雖然PSA的特異性在前列腺上皮細胞內(nèi)產(chǎn)生，對前列腺組織定量檢測PSA可以反映前列腺細胞生成它的能力，但由于在各種前列腺良、惡性疾病時，少量PSA可以泄露到外周血中，使得這種測定準確性不高。而PSA mRNA是PSA的信使基因，是PSA合成的關(guān)鍵蛋白，對PSA的特異性、相關(guān)性非常高，測定前列腺組織PSA mRNA可以間接反映上皮細胞生成PSA的能力。雖然外周血中PSA mRNA也會有一定的泄露，但是其離開前列腺上皮細胞就失去了轉(zhuǎn)錄成PSA的環(huán)境，對測定前列腺組織生成PSA能力的影響十分微弱。本研究大大提高了定量結(jié)果的準確性。

本研究發(fā)現(xiàn)合并炎癥組的PSA生成能力比無炎癥BPH組要高，但無顯著性差異。這可能是因為前列腺組織受到炎癥的刺激，誘導(dǎo)其增殖能力增強，抑制其正常的細胞凋亡程序，從而導(dǎo)致前列腺上皮細胞內(nèi)的PSA含量增多。本研究在基因水平證明低分化PCa細胞PSA生成能力下降。

本實驗對三種疾病分組的組織PSA mRNA表達量與外周血PSA水平的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果顯示在無炎癥BPH組中二者有明顯的相關(guān)性，而在合并炎癥BPH組和PCa組中，二者無明顯的相關(guān)性。這可能由于這兩組外周血PSA含量增高的途徑相似，都是前列腺上皮細胞內(nèi)的PSA 泄露到細胞外引起?？蛇@兩種疾病導(dǎo)致泄露的機制可能完全不同，PCa的前列腺組織基底膜受到癌細胞的侵襲而殘缺不全，失去屏障作用，即使前列腺組織的PSA生成能力變化不大，而外周血PSA水平卻明顯升高。合并炎癥BPH組的外周血PSA的升高可能是因為炎癥引起了一系列的炎癥反應(yīng)，如細胞損傷、變態(tài)反應(yīng)等，使前列腺細胞遭到破壞，而造成PSA的泄露。

4 參考文獻

1Dijkman GA,Debruyne FM.Epidemiology of prostate cancer〔J〕.Eur Urol,1996；30(3):281-95.

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3Rippey JH,Wener MH,Horoszewicz J,etal.Workgroup standardization of PSA 〔J〕.Cancer,1993;71(8):2678.

4汪志偉,林成楚,李 毅,等.老年前列腺手術(shù)前后血清游離/總PSA水平變化及意義〔J〕.中國老年學雜志,2010；30(9):1282-3.

5張幕淳,計國義,孔祥波,等.血清fPSA對老年前列腺癌診斷的應(yīng)用價值〔J〕.中國老年學雜志,2004；24(6):502-4.