夏明武 秦 勇 許 浩 胡光民

(合肥市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽 合肥 230038)

我國自發(fā)性腦出血(ICH)患者占全部腦卒中患者的30%左右，急性期病死率約為30%～40%。中藥黃芪是常用的益氣活血藥，近年來被用于腦出血的治療，有一定效果，但其具體的作用機制尚不明確。本研究觀察黃芪注射液對腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠48只，體重250～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(編號0001956)。

1.2藥物與試劑 黃芪注射液：正大青春寶業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z33020179 10 ml/支；CD34抗體：購自Santa Cruz Biotechnology公司，產(chǎn)品編號 sc-7324；兔抗微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)多克隆抗體：購自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號M3696；SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒：購自武漢博士德生物試劑公司。

1.3方法

1.3.1動物的處理及取材 48只SD大鼠隨機分為模型組和黃芪治療組，每組24只。術(shù)后1 h開始給藥，黃芪治療組于造模后1 h開始腹腔注射黃芪注射液(10 ml/kg-1/d-1)。模型組給予等量的生理鹽水腹腔注射，均為連續(xù)7 d。術(shù)后第7天和第14天在兩組中分別取12只大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分，然后10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血2 ml，入抗凝管，立即送安徽醫(yī)科大學(xué)，流式細(xì)胞儀檢測外周血CD34+細(xì)胞的含量；經(jīng)左心室至主動脈4%多聚甲醛溶液(4℃)灌注取腦，脫水，石蠟包埋。

1.3.2大鼠分組及腦出血模型的制備 參考大鼠腦立體定位圖譜以Yang等〔1〕方法造模，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射，將大鼠麻醉固定在立體定位儀上，在前囟前0.2 mm，矢狀縫向右旁開3.0 mm，處顱骨鉆孔。取0.1 ml尾動脈血，以顱骨外板高度為零點將頭皮針刺入腦內(nèi)，進針深度為6 mm。將75 μl自體不凝血(肝素抗凝)緩慢注入基底節(jié)區(qū)，留針10 min后緩慢拔針，手術(shù)部位消毒后縫合皮膚，放回籠中喂養(yǎng)。術(shù)后根據(jù)Berderson等〔2〕評分標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)功能缺損0分；注射對側(cè)前爪不能伸直1分；出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象2分；行走時身體向?qū)?cè)傾倒3分；無反應(yīng)，完全不能行走4分。神經(jīng)癥狀1～3分為造模成功。

1.3.3神經(jīng)行為學(xué)評價 通過觸須誘發(fā)大鼠前肢放置實驗測試神經(jīng)行為學(xué)，每只大鼠每個前肢重復(fù)刺激10次，記錄觸須刺激后前肢放置于工作臺面的次數(shù)所占百分?jǐn)?shù)。

1.3.4免疫組織化學(xué)染色 腦組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，采用SABC法行MAP-2免疫組化染色，檢測免疫陽性細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。用Image-Pro Plus 5.0進行圖像分析，400倍鏡下視野測量MAP-2表達的平均光密度值(MOD)。每例標(biāo)本取4張片子，每張片子出血區(qū)周圍隨機取5個視野，取平均值。所用MOD值采集均在相同光學(xué)和光鏡條件。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能評分 在前肢放置實驗中，黃芪治療組在第7天及第14天的神經(jīng)功能評分(0.398±0.071，0.638±0.023)明顯高于同時間點模型組的評分(0.168±0.066,0.326±0.047)(P<0.05)，且同組中第14天的神經(jīng)功能評分高于第7天時的評分(P<0.05)，表明腦出血大鼠經(jīng)用黃芪治療后可以促進神經(jīng)功能的恢復(fù)，并隨著時間的推移，恢復(fù)效果也明顯。

2.2外周血CD34+細(xì)胞含量的比較 用CD34+細(xì)胞占動脈血有核細(xì)胞百分比表示。黃芪治療組第7、14天外周血CD34+細(xì)胞含量(0.199±0.112)、(0.153±0.038)〕明顯高于同時間點的模型組〔(0.074±0.028)、(0.030±0.057)%〕(P<0.05)，同組中第14天的外周血 CD34+細(xì)胞含量低于第7天時的含量(P<0.05)，表明黃芪對內(nèi)源性骨髓干細(xì)胞有動員作用，動員作用隨著時間的推移而下降。

2.3MAP-2蛋白表達比較 黃芪治療組第7、14天的MAP-2蛋白表達水平(0.193±0.038、0.240±0.112)高于同時間點模型組(0.080±0.017、0.124±0.028)(P<0.05)，同組中第14天的MAP-2蛋白表達水平高于第7天的表達水平(P<0.05)。表明腦出血大鼠經(jīng)用黃芪治療后可以促進血腫周圍MAP-2蛋白的表達，且隨著時間的推移腦出血血腫中心MAP-2蛋白表達水平增高。圖1。

術(shù)后7 d模型組 術(shù)后7 d黃芪治療組 術(shù)后14 d模型組 術(shù)后14 d黃芪治療組

3 討 論

自發(fā)性腦出血可導(dǎo)致神經(jīng)元的急性損傷和壞死，從而導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能障礙。近年來內(nèi)源性干細(xì)胞的動員成為重塑受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重要途徑之一，骨髓中含有骨髓造血干細(xì)胞和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞兩大類干細(xì)胞，骨髓造血干細(xì)胞主要分化成各種血細(xì)胞；骨髓間質(zhì)干細(xì)胞能產(chǎn)生表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及血管內(nèi)皮生長因子等，具有轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細(xì)胞的能力〔3〕。Mezey等〔4，5〕研究認(rèn)為，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞能夠遷移到受損的腦組織區(qū)域并分化成不同的腦組織細(xì)胞，以修復(fù)受損腦組織，從而起到神經(jīng)修復(fù)和功能康復(fù)作用。

來源于骨髓造血干/祖細(xì)胞的CD34抗原具有黏附、加速血管前內(nèi)皮細(xì)胞聚集形成血管的功能，CD34抗原的表達隨著細(xì)胞的成熟會逐漸逐漸減弱至消失〔6〕。所以，外周血CD34+細(xì)胞數(shù)可以間接評價外周血干細(xì)胞含量，同時CD34+細(xì)胞也是內(nèi)皮前體細(xì)胞的來源，CD34+細(xì)胞的水平可以反映血管內(nèi)皮功能變化，CD34抗原可作為檢測新生血管的標(biāo)志性抗原。本文說明黃芪可以骨髓干細(xì)胞入血。CD34+細(xì)胞在體內(nèi)能遷移到缺血部位參與新生血管形成及血管內(nèi)皮的修復(fù)，改善微循環(huán)，促進血流恢復(fù)和神經(jīng)再生〔3〕。

微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)主要表達在神經(jīng)元胞體內(nèi)微管及樹突上〔7〕，參與神經(jīng)元的生長和損傷后修復(fù)過程〔8〕，被認(rèn)為是 研究神經(jīng)再塑的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，模型組血腫周邊只有少量MAP-2表達，而黃芪治療組血腫周邊MAP-2表達增強，表明通過黃芪的治療作用血腫周邊的神經(jīng)軸突和樹突增生相對活躍，出現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生。

腦出血造成的病理性損傷主要包括出血對腦實質(zhì)的機械性破壞，繼發(fā)腦缺血、腦水腫、炎癥及細(xì)胞凋亡等〔9〕。黃芪注射液對腦出血的神經(jīng)功能保護作用的機制可能是：①抑制炎性細(xì)胞分泌〔10〕，減輕腦水腫，起到神經(jīng)保護的作用。②減少腦出血灶早期神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放及提高Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的活性，從而減輕腦出血灶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔11〕。③擴張血管、降低周圍血管阻力，改善微循環(huán)〔12〕；降低血腦屏障的通透性〔10〕，減輕腦水腫。④抑制腦出血急性期星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化和GFAP的過度表達，從而有利于腦出血損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)〔9〕。

本實驗發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可以明顯改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能，其作用機制可能是動員足量的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞遷移至腦出血區(qū)及周邊，促進新生血管形成及血管內(nèi)皮的修復(fù)血管，促進神經(jīng)的再生修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)。

4 參考文獻

1Yang GY， Bets AL，Chenevert TL，etal.Experimental intracerebral hemorrhage：relationship between brain edema，blood flow,and blood-brain barrier permeability in rats〔J〕.Neurosurg，1994；81(1)：93-102.

2Bederson JB，Pitts LH，Tiles M,etal.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination 〔J〕.Stroke，1986；17(6)：472-6.

3何曉英，袁 平，譚 華，等.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對腦出血大鼠腦水腫及血管再生的影響 〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009；13(19):3661-4.

4Mezey E，Key S，Vogelsang G，etal.Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003； 100(3)：1364-9.

5賈麗君，范 佳，劉 群.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對大鼠腦出血后神經(jīng)功能損傷的保護〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010；30(2):513-5.

6Shi Q，Rafii S，Wu MH,etal.Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells〔J〕.Blood，1998;92(2):362-7.

7Matus A.Microtubule-associated proteins：their potential role in determining neuronal morphology〔J〕. Annu Rev Neurosci，1988；11(1)：29-44.

8吳 旭，楊 麗，王保捷，等.MAP-2 在大鼠腦損傷后表達變化的時間規(guī)律性研究〔J〕.中國法醫(yī)學(xué)雜志,2011；26(4):269-72.

9Mutlu N，Berry RG，Alpers BJ.Massive cerebral hemorrhage:clinical and pathological correlations〔J〕.Arch Neurol，1963；8(10):644-61.

10范崇桂，王桂敏.黃芪改善腦出血大鼠血腦屏障損傷及TNF-α機制的研究.〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008；6(11):1312-3.

11孫 征，王登科，張海宇，等.黃芪注射液對早期大鼠腦出血灶周圍神經(jīng)元CytC和線粒體ATPase 的影響〔J〕.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011;33(5):407-10.

12吳發(fā)寶，陳希元.黃芪藥理作用研究綜述〔J〕.中藥材,2004； 27(3)：232-4.