周玲玲 袁冬平 張興德 許 立 方泰惠

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江蘇省中藥藥效與安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029)

原發(fā)性肝癌是我國常見的一種惡性腫瘤，肝動(dòng)脈栓塞術(shù)是目前臨床采用的重要治療方法之一〔1，2〕。采用藥物微球經(jīng)肝動(dòng)脈介入，可栓塞至肝腫瘤的末梢動(dòng)脈，具有栓塞和緩釋藥物的雙重功能。由于腫瘤細(xì)胞具有周期性特點(diǎn)，聯(lián)合用藥遠(yuǎn)比單用一種藥物效果要好，課題組嘗試將抗腫瘤療效確切的莪術(shù)油和絲裂霉素聯(lián)合制成中西藥復(fù)方制劑，進(jìn)行了前期的制備工藝研究，研制成符合肝動(dòng)脈栓塞要求的復(fù)方莪術(shù)油微球(CCAO- MS)制劑，并建立了大鼠移植性肝癌模型，初步證實(shí)了對肝癌的治療作用，探討了其部分機(jī)制〔3～6〕。本文進(jìn)一步探討其經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞治療大鼠移植性肝癌對腫瘤組織增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品試劑、動(dòng)物及細(xì)胞株 莪術(shù)油：橙黃色油狀液體，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室提取；絲裂霉素：紫黑色粉末(無錫三和藥業(yè)提供)；空白微球(B-MS)，CCAO-MS南京中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室提供，微球粒徑為(72.01±7.65)μm，平均載藥量為9.45%，體外藥物釋放符合一級釋放模型。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)化DUTP缺口末端標(biāo)技技術(shù)(TUNEL)試劑盒(Roche 公司產(chǎn)品)。大鼠半胱氨酸天門氨酸蛋白酶(Caspase)-3一抗、增殖核抗原(PCNA)一抗、免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)。SD大鼠，體質(zhì)量200～300 g，雌雄各半；由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號：SCXK(蘇)2005-0018。大鼠Walker-256瘤株由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陸茵教授惠贈(zèng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠移植性肝癌模型的建立、分組和給藥〔5，6〕SD大鼠，參照前期建立的方法復(fù)制大鼠移植性肝癌，成功復(fù)制的大鼠隨機(jī)分為三組，每組15只，即： ①生理鹽水組，肝動(dòng)脈插管灌注0.2～0.3 ml生理鹽水；②B-MS組，按10 mg/kg體重經(jīng)肝動(dòng)脈插管灌注；③CCAO-MS組，按10 mg/kg體重經(jīng)肝動(dòng)脈插管灌注。于瘤塊移植后7 d，于胃十二指腸動(dòng)脈上切一小口，以29 G胰島素注射器上行進(jìn)入肝固有動(dòng)脈。按以上分組及劑量分別灌注相應(yīng)制劑。灌注后結(jié)扎胃十二指腸動(dòng)脈近端，放開肝總動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾。逐層縫合切口后外涂金霉素軟膏，分籠飼養(yǎng)。于治療7 d后處死動(dòng)物，進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.2.2肝腫瘤組織凋亡檢測〔7〕每組各隨機(jī)選取5個(gè)樣本切片，采用TUNEL法檢測腫瘤組織原位凋亡情況。光鏡下觀察切片的染色反應(yīng)，以細(xì)胞核有明顯棕黃色為陽性細(xì)胞。計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算TUNEL陽性標(biāo)記指數(shù)(TUNEL-LI)，即凋亡指數(shù)。TUNEL-LI=(表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.3PCNA的檢測 標(biāo)本同上切片處理，按照試劑盒說明書免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞PCNA的變化了解細(xì)胞增殖情況。

1.2.4腫瘤組織Caspase-3表達(dá)的檢測 標(biāo)本同上切片處理，采用免疫組織化學(xué)法，參照說明書進(jìn)行。顯微鏡下觀察，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃(褐)色為陽性細(xì)胞，各樣本進(jìn)行評分0～3分：0分：陰性表達(dá)；1分：輕度表達(dá)；2分：中度表達(dá)；3分：重度表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1CCAO-MS對移植性肝癌大鼠肝腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)肝動(dòng)脈灌注CCAO-MS后肝腫瘤凋亡明顯增多，細(xì)胞核內(nèi)及少數(shù)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒，凋亡細(xì)胞散在分布，細(xì)胞核固縮或正常，凋亡指數(shù)〔(33.4±7.37)%〕明顯高于生理鹽水組〔(3.62±1.75)%〕和B-MS組〔(5.92±2.04)%〕(P<0.01)。見圖1。

2.2CCAO-MS對移植性肝癌大鼠肝腫瘤表達(dá)PCNA的影響 生理鹽水組大鼠肝臟腫瘤組織PCNA表達(dá)較強(qiáng)；復(fù)方莪術(shù)油微球組大鼠肝臟內(nèi)瘤組織內(nèi)PCNA表達(dá)較弱。見圖2。

生理鹽水組 B-MS組 CCAO-MS組

生理鹽水組 B-MS組 CCAO-MS組

2.3CCAO- MS對移植性肝癌大鼠肝腫瘤表達(dá)Caspase-3的影響 生理鹽水組大鼠肝臟腫瘤組織Caspase-3表達(dá)(0.20±0.45)較低；CCAO-MS組(2.60±0.55)大鼠肝臟腫瘤組織內(nèi)表達(dá)較B-MS組(0.60±0.55)及生理鹽水組增強(qiáng)(P<0.01)。見圖3。

生理鹽水組 B-MS組 CCAO-MS組

3 討 論

CCAO-MS制劑采用莪術(shù)油和MMC兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用，莪術(shù)是活血化瘀藥，其抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注，而且其可促進(jìn)其他抗腫瘤藥物的吸收〔8〕；MMC具有非特異作用于腫瘤細(xì)胞增殖各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)。制成微球制劑肝動(dòng)脈灌注給藥，針對性強(qiáng)，抗腫瘤同時(shí)可減少全身不良反應(yīng)，課題組前期完成了CCAO-MS的制備工藝研究，并采用Walker-256瘤株成功復(fù)制了大鼠移植性肝癌模型，在此基礎(chǔ)上證實(shí)了其治療大鼠移植性肝癌較單用莪術(shù)油和MMC具有增效減毒作用〔4，5〕。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡受阻密切相關(guān)，腫瘤組織除了增殖活性以外，同時(shí)還存在細(xì)胞凋亡。對于具有同等增殖能力的腫瘤而言，如果細(xì)胞凋亡率減少，將使腫瘤細(xì)胞凈生長率提高，預(yù)后則更差〔9，10〕。研究顯示CCAO-MS可阻滯腫瘤細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞株的細(xì)胞周期而抑制其增殖，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡〔6〕，在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察了CCAO-MS對移植性肝癌大鼠的肝腫瘤細(xì)胞的凋亡過程的影響。結(jié)果顯示：復(fù)方微球可明顯促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞的凋亡，說明其可在肝臟腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，從而進(jìn)一步抑制其腫瘤組織的生長速度，這可能是其治療肝癌的機(jī)制之一。

細(xì)胞的增殖和凋亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控，在此過程中，PCNA、Caspase家族等均發(fā)揮了不同的作用〔11，12〕。PCNA是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的良好指標(biāo)，而Caspase-3為關(guān)鍵的凋亡分子，在細(xì)胞凋亡早期的啟動(dòng)與執(zhí)行過程中起著重要作用〔13〕。本結(jié)果提示CCAO-MS的抗腫瘤作用可能與下調(diào)PCNA的表達(dá)和上調(diào)Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

綜上，CCAO-MS經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞對大鼠移植性肝癌有明顯的治療作用，且可調(diào)控腫瘤增殖與凋亡的相關(guān)基因，其采用中西藥合用，較單用中藥和西藥均有獨(dú)特的優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景。

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