宋秋穎 張?jiān)隼?張 偉 潘艷明 任鳳云 馮玉寬

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

血管和淋巴管新生的程度是實(shí)體腫瘤無(wú)限增殖、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移潛能大小的直接影響因素之一，更是腫瘤細(xì)胞自給式生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一，同時(shí)亦是包括肺癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤的主要惡性表型之一〔1,2〕。目前，多數(shù)實(shí)體腫瘤的靶向治療就是基于阻斷血管和淋巴管新生理論產(chǎn)生的。盡管如此，實(shí)體瘤血管和淋巴管新生在分子水平調(diào)控機(jī)制并不十分清楚。本研究以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-C為靶點(diǎn)，研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默A549細(xì)胞VEGF-C 基因表達(dá)對(duì)VEGF家族因子及其受體和下游信號(hào)通路的影響。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株及主要試劑 人非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，細(xì)胞起源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC),用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(美國(guó)Invitrogen 公司)。PSIH1-H1-copGFP shRNA Vector及慢病毒載體系統(tǒng)為美國(guó)System Biosciences公司產(chǎn)品;TRIzol 試劑、內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于大連TaKaRa公司;抗VEGF-C、 VEGF-A、VEGFR-2、VEGFR-3、pVEGFR-2抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，p-VEGFR-3、p-ERK1/2、p-AKT、p-p38、ERK1/2、AKT、p38、GAPDH 抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，二抗均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，蛋白提取試劑、蛋白定量試劑盒及ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司，PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司;ELISA檢測(cè)試劑盒Quantikine Human VEGF-C Enzyme-Linked Immunoassay 購(gòu)于美國(guó)R&D公司。

1.2構(gòu)建靶向VEGF-C 基因的干擾質(zhì)粒pSIH1-H1-copGFP-VEGF-C 根據(jù)VEGF-C(NM005429) mRNA 序列信息，使用siRNA Target Finder在線siRNA序列設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)針對(duì)其CDS 區(qū)的siRNA 序列:5′- CCTCAGCAAGACGTTATTT -3′，根據(jù)siRNA序列，設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)的DNA模板單鏈，模板鏈包括siRNA的正義鏈和反義鏈，中間以12個(gè)脫氧核苷酸的Loop結(jié)構(gòu)(5′-CTTCCTGTCAGA-3′)相連，后面接有RNA PolyⅢ聚合酶轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(TTTTT)，同時(shí)模板鏈兩端分別添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，退火形成互補(bǔ)雙鏈DNA。pSIH1-H1-copGFP shRNA 質(zhì)粒雙酶切后與上述退火產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細(xì)菌，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種LB 培養(yǎng)基，37℃、300 r/min搖床培養(yǎng)16 h，提取pSIH1-H1-copGFP-VEGF-C質(zhì)粒，測(cè)序并進(jìn)行序列分析。

1.3重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C的包裝和生產(chǎn) 使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293TN細(xì)胞(System Biosciences，Cat. # LV900A-1)，0.6 ml胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至10 cm貼壁細(xì)胞培養(yǎng)皿上，每皿接種數(shù)目為1.5×106個(gè)，接種24 h后，細(xì)胞貼壁密度約為85%，細(xì)胞梭型，中央發(fā)亮，形態(tài)飽滿，適合轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。使用LipofectamineTM 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒用量為L(zhǎng)entivirus Package plasmids mix(500 ng/μl)，22 μl；Lv-VEGF-C siRNA plasmid DNA(500 ng/μl)，4 μl；轉(zhuǎn)染試劑用量每10 cm培養(yǎng)皿為40 μl。轉(zhuǎn)染后48 h，鏡下觀察細(xì)胞液發(fā)黃，貼壁細(xì)胞密度約為90%，細(xì)胞扁平，貼壁狀態(tài)較好。收集細(xì)胞上清，5 000 r/min離心5 min，去掉細(xì)胞碎片沉淀，然后使用0.45 μm的PVDF膜過(guò)濾上清液，冰浴條件下過(guò)夜保存；梯度稀釋法進(jìn)行重組慢病毒滴度測(cè)定，使用dPBS(pH7.8,實(shí)驗(yàn)室配制)將病毒顆粒濃度調(diào)整至1×104ifu/μl，按1 ml每管濃度調(diào)整后的病毒液進(jìn)行分裝，-70℃保存待用。所收集的病毒分別命名為L(zhǎng)v-siRNA-VEGF-C組和Lv-Con(空載質(zhì)粒組)。

1.4重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549細(xì)胞 接種處于對(duì)數(shù)生成長(zhǎng)期的A549細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞，分別加入100、50、40、30、20、10 μl標(biāo)準(zhǔn)copGFP標(biāo)記的病毒液(1×104ifu/μl)感染A549細(xì)胞，換液后72 h，熒光倒置顯微鏡下觀察，綠色熒光表達(dá)比較穩(wěn)定，使用胰酶消化的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定細(xì)胞感染效率達(dá)到100%時(shí)最少病毒用量，計(jì)算最佳MOI 值。按照最佳MOI添加病毒液，同時(shí)設(shè)Lv-Ctrl 組和未轉(zhuǎn)染組，37℃和5% CO2的條件下正常培養(yǎng)。放大培養(yǎng)細(xì)胞克隆，挑取最穩(wěn)定的克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并且收集不同代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。

1.5Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞VEGF-C及VEGF家族因子和信號(hào)通路的蛋白表達(dá) 分別收集Lv-siRNA-VEGF-C細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞1.5×106個(gè)，加入4℃預(yù)冷的蛋白裂解液充分裂解，4℃條件下12 000 r/min 離心15 min，收集上清使用BCA法進(jìn)行總蛋白濃度檢測(cè)。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，常溫封閉2 h，TBST 緩沖液沖洗2遍，分別加入VEGF-C,VEGF-A,VEGFR-2,VEGFR-3,pVEGFR-2,p-VEGFR-3,p-ERK1/2,p-AKT,p-p38,ERK1/2,AKT,p38,GAPDH一抗，4℃過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入二抗后室溫反應(yīng)1 h;TBST 洗膜3次，每次10 min。曝光、顯影、漂洗、再定影。采用灰度掃描軟件TotalLab進(jìn)行膠片掃描，分析檢測(cè)結(jié)果。

1.6ELISA法檢測(cè)細(xì)胞VEGF-C蛋白的分泌 取96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞上清液，每孔取100 μl，4℃和3 000 r/min離心2 min，去除細(xì)胞碎片。加入100 μl of Assay Diluent RD1W。然后分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中加入待測(cè)上清液50 μl，使用封板膜封板后置室溫?fù)u床500 r/min條件處理2 h；使用Wash Buffer洗板4次，無(wú)菌吸水紙上倒置拍板，盡量甩出孔中殘留的洗液；每孔加入200 μl VEGF-C Conjugate，使用新的封板膜重新封板，室溫500 r/min搖床處理；每孔添加200 μl Substrate Solution,室溫避光孵育30 min；每孔加終止液50 μl Stop Solution，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD 值)。

2 結(jié) 果

2.1重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 成功感染A549細(xì)胞 對(duì)重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C測(cè)序結(jié)果表明，插入片段與設(shè)計(jì)的VEGF-C shRNA核苷酸序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)有突變、缺失、插入等異常存在，表明已經(jīng)成功構(gòu)建靶向VEGF-C 基因的重組慢病毒載體Lv-siRNA-VEGF-C。將重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549細(xì)胞，慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549 細(xì)胞的效率達(dá)90%(圖1)。

圖1 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549細(xì)胞(×200)

2.2重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染下調(diào)A549細(xì)胞中VEGF-C蛋白的表達(dá)和分泌 慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染后，A549 細(xì)胞中VEGF-C 蛋白的表達(dá)量明顯降低。與未感染組A549細(xì)胞相比，慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染后，A549細(xì)胞中VEGF-C 蛋白的表達(dá)水平〔( 0.23±0. 02) vs( 0.54±0.03),P<0.01〕和72 h的蛋白分泌水平〔(764.90±204.33) pg/ml vs (3 355.06±256.93) pg/ml〕明顯降低。見(jiàn)圖2。

1)P<0.05，2)P<0.01

2.3重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549細(xì)胞VEGF家族因子及其受體的表達(dá) 與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞相比，VEGF-A,VEGFR-2,VEGFR-3的蛋白表達(dá)在Lv-siRNA-VEGF-C細(xì)胞中明顯減少，分別減少了61.77%、57.30%和73.75%(P<0.001)。見(jiàn)圖3。

圖3 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染抑制A549細(xì)胞VEGF家族因子及其受體的表達(dá)

2.4重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549細(xì)胞VEGFRs磷酸化水平ERK、AKT和p38信號(hào)通路活性 VEGF-C RNA干擾可顯著降低VEGFR-2和VEGFR-3磷酸化水平，同時(shí)也降低了VEGFR-2和VEGFR-3介導(dǎo)的ERK1/2，AKT和p38-MAPK信號(hào)通路的磷酸化水平。見(jiàn)圖4。

圖4 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染抑制A549細(xì)胞VEGFRs磷酸化水平和ERK、AKT和p38信號(hào)通路活性

3 討 論

在眾多調(diào)控因子中，VEGF-A、VEGF-C及其受體VEGFR-2和VEGFR3是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血管和淋巴管生成的主要因子，已經(jīng)成為以病理性血管和淋巴管生成信號(hào)通路為標(biāo)靶的腫瘤靶向治療的首選標(biāo)靶〔3〕。近期的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C及其受體VEGFR-3表達(dá)于許多惡性腫瘤細(xì)胞，并且證實(shí)許多腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移與VEGF-C和VEGFR-3組成的自分泌信號(hào)軸相關(guān)，而且VEGF-C除了傳統(tǒng)認(rèn)為的參與腫瘤淋巴管生成之外，還是腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，具有多重生物學(xué)作用〔4，5〕。 本研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾沉默VEGF-C基因表達(dá)可明顯抑制VEGF-C和VEGFR-3的表達(dá)，并同時(shí)抑制了VEGF-A和VEGFR-2的表達(dá)，而VEGF-A和VEGFR-2則是調(diào)控血管生成的關(guān)鍵信號(hào)軸。因此，VEGF-C與VEGF家族因子和受體之間存在著自分泌調(diào)控關(guān)系，這將為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征提供新的實(shí)驗(yàn)支撐材料。VEGF-C/VEGFR-3和VEGF-A/VEGFR-2信號(hào)軸分別被認(rèn)為是調(diào)控淋巴管和血管生成的關(guān)鍵因素，因此，干擾VEGF-C基因的表達(dá)同時(shí)阻斷了上述兩條信號(hào)軸，那么，是否通過(guò)抑制VEGF-C基因表達(dá)可同時(shí)抑制腫瘤的血管和淋巴管生成，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和證實(shí)。

許多研究顯示，AKT、ERK和p38信號(hào)分子的磷酸化是調(diào)控細(xì)胞增殖和生存的關(guān)鍵步驟。亦有研究顯示，通過(guò)抑制ERK和AKT信號(hào)通路可具有抑制肝癌發(fā)生發(fā)展和具有抗腫瘤血管生成作用〔6〕。在內(nèi)皮細(xì)胞，VEGFRs介導(dǎo)的AKT、ERK和p38信號(hào)通路的激活已被廣泛認(rèn)知。然而，在腫瘤細(xì)胞，VEGFRs介導(dǎo)的AKT、ERK和p38信號(hào)通路如何被激活及如何起作用少有報(bào)道。Morelli等〔7〕的研究證實(shí)，在胃腸腫瘤細(xì)胞，VEGFR抑制劑可抑制VEGFR的磷酸化水平，并且同時(shí)抑制了下游信號(hào)分子AKT和ERK的磷酸化水平。Svensson等〔8〕在乳腺癌細(xì)胞則發(fā)現(xiàn)ERK的磷酸化與VEGFR-2的表達(dá)相關(guān)。在肺癌細(xì)胞，Su等〔3〕發(fā)現(xiàn)人為去除VEGFR-3的激酶活性會(huì)導(dǎo)致p38MAPK的磷酸化水平降低，而不影響ERK的磷酸化水平。本研究顯示，RNA干擾沉默VEGF-C基因表達(dá)可同時(shí)明顯抑制AKT、ERK和p38信號(hào)分子的磷酸化活性，這將導(dǎo)致AKT、ERK和p38信號(hào)通路同時(shí)受到阻滯，進(jìn)而抑制了上述信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和血管、淋巴管生成方面發(fā)揮作用。

4 參考文獻(xiàn)

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