賀潤麗，平莉莉，王倫宇，楊 靜，郭慧青

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

款冬花為常用中藥，是菊科款冬屬植物款冬（Tussilago farfara L.）的干燥花蕾，又名看燈花、西冬花、九九花等，味辛、甘，性溫，具潤肺下氣、止咳化痰之功效，可用于治療急、慢性支氣管炎及肺結(jié)核、咳嗽、咳吐膿血等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，款冬花有明顯的止咳、袪痰、平喘、升壓和抗炎等作用[1]。國內(nèi)外已對(duì)款冬花的活性成分、藥理作用、栽培等方面進(jìn)行了大量的研究報(bào)道[2-9]，但有關(guān)從分子水平上研究款冬資源的遺傳多樣性目前尚未見報(bào)道。

隨著臨床用藥的增大和自然環(huán)境的惡化，款冬野生資源日益枯竭，目前市場上銷售的款冬花藥材以栽培品為主，且主產(chǎn)于甘肅、陜西、山西、四川等地[2-3，9]?？疃ㄔ耘嘁愿o進(jìn)行無性繁殖，品質(zhì)逐年下降，由于對(duì)其遺傳背景、親緣關(guān)系缺乏深入系統(tǒng)的研究，致使育種工作受到很大限制，急需從分子水平上研究我國款冬資源的遺傳多樣性。

本研究利用SRAP技術(shù)，對(duì)16個(gè)來自于不同地區(qū)野生和栽培的款冬種質(zhì)資源進(jìn)行分析，旨在從分子水平探討款冬的遺傳差異，為可持續(xù)利用和保護(hù)種質(zhì)資源、選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

于2012年10—11月款冬花蕾采收期采樣，采集到山西省11個(gè)縣區(qū)的野生居群11份以及甘肅、河北、內(nèi)蒙古的野生和栽培居群5份，共計(jì)16份種質(zhì)資源，將采集的材料潔凈后硅膠快速干燥葉片帶回實(shí)驗(yàn)室，各居群的采集信息列于表1。供試材料均由山西中醫(yī)學(xué)院裴香萍副教授鑒定，為菊科款冬屬植物款冬（Tussilago farfara L.）。

表1 樣品編號(hào)及來源

1.2 試驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1 儀器 1-14型臺(tái)式離心機(jī)（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），3K30恒溫水浴鍋（上海申騰生物技術(shù)有限公司），BIOPHOMETER核酸測定儀（EPPENDORF，德國），PTC-200 PCR儀（M.J.RESEARCH，USA），DYY-Ⅲ5電泳儀和 DYCZ-30C電泳槽（北京市六一儀器廠），BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2.2 試劑 丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、37%甲醛、TEMED、硝酸銀、β-巰基乙醇、瓊脂糖、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、Taq 酶、DNA Marker及 dNTPs等，均購自TaKaRa公司；SRAP引物于上海生工生物工程有限公司合成；NaCl，KAc等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 每個(gè)居群取20個(gè)單株的葉片等量混合，采用改進(jìn)的CTAB提取法[10]提取葉片總DNA，存放于-20℃冰箱備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與篩選 參照Li等[11]發(fā)表的引物，設(shè)計(jì)了9個(gè)上游引物（ME1～ME9）和11個(gè)下游引物（EM1～EM11），如表2所示。

1.3.3 SRAP反應(yīng)及電泳分析檢測 SRAP-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括模板DNA 100 ng，10×PCR buffer 2.0μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6μL，10μmol/L上、下游引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶1 U，用超純水補(bǔ)足至20μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性 1 min，50℃復(fù)性 1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物加入6.0μL 6×loadingbuffer，8%非變性丙烯酰胺凝膠檢測，電泳緩沖液為1×TBE，穩(wěn)壓200 V，電泳至二甲苯青到凝膠底部時(shí)結(jié)束。采用硝酸銀染色觀察結(jié)果，染色后掃描儀掃描、記錄。

表 2 SRAP 引物序列（5′→ 3′）

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜，僅統(tǒng)計(jì)100～2 000 bp之間有差異、易于識(shí)別的多態(tài)性條帶，在相同遷移位置有條帶的記為1，無條帶的記為0，形成0，1矩陣，建立數(shù)據(jù)表格。

利用NTsys 2.10e分析軟件、SM法計(jì)算遺傳相似系數(shù)（GS），對(duì)結(jié)果以非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 居群的多態(tài)性條帶比率分析

表3 篩選的多態(tài)性引物及擴(kuò)增結(jié)果

從表3可以看出，從99對(duì)引物中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶信號(hào)強(qiáng)、重復(fù)性好、特征性好的11對(duì)引物。用11對(duì)引物組合對(duì)1個(gè)居群的款冬材料進(jìn)行擴(kuò)增，得到121條DNA條帶，其中，多態(tài)性條帶79條，多態(tài)性比率為65.3%，平均產(chǎn)生多態(tài)性條帶7.2條，多態(tài)性比率在36.4%～100%之間。其中，引物組合ME9-EM5的SRAP擴(kuò)增反應(yīng)圖譜如圖1所示。

2.2 不同居群的遺傳相似系數(shù)與聚類結(jié)果分析

根據(jù)11對(duì)引物組合的SRAP擴(kuò)增數(shù)據(jù)，用NTsys 2.10e軟件計(jì)算各個(gè)種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果（表4）表明，不同居群款冬樣品間的相似系數(shù)變化范圍為0.342～0.810，均值為0.587，表明供試材料多態(tài)性高、遺傳變異豐富。其中，山西廣靈款冬野生居群和河北蔚縣栽培居群的相似系數(shù)最高，為0.810，表明二者親緣關(guān)系最近；而山西廣靈野生居群和甘肅天水秦州栽培居群的相似系數(shù)最小，為0.342，表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表4 16個(gè)居群的遺傳相似系數(shù)

由圖2可知，以遺傳相似系數(shù)0.614為閾值，將各居群款冬分成五大類群，第Ⅰ類群以山西廣靈野生居群和河北蔚縣栽培居群聚在一起后，與內(nèi)蒙古興和的栽培居群、婁煩的野生居群聚在一起；第Ⅱ類群以山西興縣的野生居群單獨(dú)成為一支；第Ⅲ類群包含了山西寧武、臨縣、太原天龍山、榆社、和順、中陽、沁源7個(gè)野生居群，其中又可分為4個(gè)小分支；第Ⅳ類群以甘肅甘谷的野生居群單獨(dú)成為一支；第Ⅴ類群以甘肅天水秦州區(qū)和隴西的栽培居群與山西夏縣的野生居群聚在一起。

3 討論

SRAP引物具有通用性，無需知道基因組信息，正反向引物兩兩搭配，降低引物合成成本[12-15]。本研究采用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同居群款冬的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行分析，顯示了一定的優(yōu)越性和可行性，且擴(kuò)增條帶較多，易辨別，重復(fù)性好，操作簡單。

用篩選到的11對(duì)SRAP引物對(duì)16個(gè)野生和栽培款冬居群的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到清晰條帶121條，其中，多態(tài)性條帶79條，多態(tài)性比率為65.3%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，供試材料間的相似系數(shù)均值較小，說明所選材料遺傳多樣性較高，各居群款冬之間存在一定的遺傳差異。

聚類分析表明，16個(gè)居群的款冬可分為五大類群，各居群并不是按地理界限嚴(yán)格地聚在一起，但與地理分布和栽培歷史有一定的相關(guān)性[16-17]，如山西廣靈、河北蔚縣、內(nèi)蒙古興和有栽培款冬的歷史，雖然在廣靈采集的是野生居群，但與內(nèi)蒙古、河北的栽培居群聚在一起，甘肅隴西和天水的2個(gè)栽培居群也聚在一起，這可能與這些地區(qū)互相引種有關(guān)。因?yàn)樵耘嗫疃揽扛o進(jìn)行無性繁殖，目前生產(chǎn)上尚無一定品種，主要依靠從野生款冬挖取根莖進(jìn)行繁殖，或者各栽培地之間相互引進(jìn)種根進(jìn)行種植。山西興縣與甘肅甘谷的野生居群各單獨(dú)聚為一分支，雖然從形態(tài)上看，二者比較相似，表現(xiàn)為花蕾淺紅色，植株纖細(xì)，但由于地理位置相距較遠(yuǎn)，各單獨(dú)聚為一支。山西的大部分野生款冬居群聚在一起，內(nèi)部又分為4個(gè)小分支，說明山西野生款冬居群遺傳基礎(chǔ)變異豐富。

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