王楠，周瑩，姚丹，尹俊琦，曲靜，王丕武

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長春 130118;2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130118)

春大豆花芽cDNA文庫的構(gòu)建及質(zhì)量分析

王楠1，周瑩1，姚丹2，尹俊琦1，曲靜1，王丕武1

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長春 130118;2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130118)

【目的】為了解大豆多莢、多粒相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建了大豆花芽cDNA文庫，根據(jù)要求初步鑒定了所構(gòu)建文庫的質(zhì)量.【方法】以大豆吉農(nóng)18突變體的幼嫩花芽為材料提取總RNA，采用SMART技術(shù)合成雙鏈cDNA.經(jīng)蛋白酶K的消化及SfiⅠ酶切后，將所得cDNA克隆到λTriplEx質(zhì)粒載體中，成功構(gòu)建了大豆花芽全長cDNA文庫.【結(jié)果和結(jié)論】將初始文庫經(jīng)擴(kuò)增后保存，檢測擴(kuò)增文庫滴度為2.13×108pfu/mL，重組率接近95.3%，菌落PCR鑒定插入片段主要分布在0.5～2.0 kb.插入片段平均大小在1.0 kb左右.表明本研究所構(gòu)建的文庫既滿足了目的基因的分離篩選，又可保證全長cDNA文庫的獲得，該文庫的構(gòu)建為進(jìn)一步開展相關(guān)基因的克隆及分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ).

大豆;花芽;cDNA文庫構(gòu)建;質(zhì)量分析

cDNA文庫是高效、大規(guī)模獲得基因序列信息的有效方法，為新基因的發(fā)現(xiàn)和功能基因的研究提供便捷、高效的途徑.與其他基因組文庫相比較，cDNA文庫中獲得的基因組是已經(jīng)經(jīng)過剪切將內(nèi)含子去除了的cDNA，因此可以在cDNA文庫中較便捷地獲得基因序列的信息［1］，并且可以直接用于該基因完整的mRNA信息的表達(dá)［2］.通過構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫不僅可保護(hù)瀕危珍惜生物資源，而且可以提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜所用的探針，更重要的是可以用于分離全長基因進(jìn)而開展基因功能研究.

我國北方春大豆生長一般分為出苗期、開花期、結(jié)莢期、鼓粒期和成熟期5個(gè)生育階段.根據(jù)以往的研究，春大豆花芽分化過程中干物質(zhì)積累量會(huì)隨著花芽分化迅速上升，單位面積干物質(zhì)量的增加可達(dá)到提高產(chǎn)量的目的［3-5］.春大豆花芽分化時(shí)主莖伸展4～5片復(fù)葉，此時(shí)是營養(yǎng)生長與生殖生長交錯(cuò)期，大豆植株生活力旺盛、生長發(fā)育快、營養(yǎng)器官與生殖器官同時(shí)建造，此時(shí)花芽部位所含基因豐富，為構(gòu)建全長cDNA文庫奠定基礎(chǔ).目前，對春大豆花芽的研究多限于生理及表觀形態(tài)學(xué)的研究，如陳傳梅等［6］研究的大豆花芽分化和物候期的機(jī)理模型，呂薇等［7］研究的大豆花芽分化和發(fā)育的掃描電子顯微鏡觀察;另有對大豆成花誘導(dǎo)、花發(fā)育及開花逆轉(zhuǎn)過程中的相關(guān)基因的研究，如馬啟斌［8］關(guān)于GmNMH7基因在大豆成花誘導(dǎo)、花發(fā)育及開花逆轉(zhuǎn)過程中的表達(dá)研究.但從分子水平揭示其與產(chǎn)量相關(guān)性的研究甚少，只有在柑橘［9］、擎天鳳梨［10］等方面有相關(guān)報(bào)道.本試驗(yàn)選取大豆吉農(nóng)18突變體為材料，構(gòu)建突變體幼嫩花芽全長cDNA文庫，以期從分子生物學(xué)角度研究調(diào)控大豆多莢、多粒相關(guān)機(jī)制，從而為大豆相關(guān)基因的克隆及增產(chǎn)的分子機(jī)理研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料本研究選取大豆吉農(nóng)18突變體為試驗(yàn)材料，該材料單株4粒莢結(jié)莢率為30%左右，與對照材料比，提高近5倍;突變體小區(qū)產(chǎn)量較對照材料提高15%左右.2012年7月在大棚內(nèi)試驗(yàn)田中取大豆吉農(nóng)18突變體6～7葉期的幼嫩花芽，用錫箔紙包裹迅速置于液氮中速凍后，儲(chǔ)存于-80℃超低溫冰箱備用.

1.1.2 引物序列合成cDNA第1條鏈引物CDSⅢ/3'PCR Primer(12 μmol/L)：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGC GGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'(N=A，G，C或T;N-1=A，G或C)，SMART IVTM Oligo-nucleotide(12μmol/L)：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3';合成cDNA第2條鏈引物5'PCR Primer(12 μmol/L)：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'.

1.1.3 試劑RNAiso Plus總RNA提取試劑盒，購自TaKaRa公司;文庫構(gòu)建試劑盒SMART cDNA Library construction kit，購自Clontech公司，其中包含宿主菌大腸埃希菌XL1-Blue菌株、BM25.8菌株及TripIEx2載體;雙鏈cDNA合成試劑盒Advantage?2 PCR Kit，購自Clontech公司;包裝蛋白MaxPlaxTMLambda packaging extract，購自EPICENTRE公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及mRNA的純化取1 g大豆葉片，按照RNAiso Plus試劑盒使用說明書的步驟提取大豆葉片總RNA.取3 μL上樣量，電壓為8～10 V/cm，經(jīng)φ為1%甲醛變性凝膠電泳，檢測提取RNA的質(zhì)量及完整性.利用DNaseI消化，消除樣品中可能含有的微量基因組DNA，用微量分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度和純度.

1.2.2 雙鏈cDNA的合成取3.0 μL純化后的mRNA，按照SMART cDNA Library construction kit試劑盒說明書中步驟，首先合成單鏈cDNA，孵育結(jié)束后放在冰上終止反應(yīng).取2.0 μL單鏈cDNA，按照SMART cDNA Library construction kit試劑盒說明書中步驟，進(jìn)行以下反應(yīng)：95℃5 min;95℃30 s，68℃6 min，30個(gè)循環(huán);最后68℃6 min結(jié)束反應(yīng).取5μL產(chǎn)物進(jìn)行11 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，檢測產(chǎn)物質(zhì)量.

1.2.3 蛋白酶K的消化及SfiⅠ酶切取50.0 μL雙鏈cDNA(2～3 μg)于高溫滅菌的0.5 mL離心管中，按照SMART cDNA Library construction kit試劑盒說明書步驟操作，所得沉淀干燥后加入79 μL去離子水回溶.向回溶的cDNA中加入下列試劑：10×SfiⅠ緩沖液10 μL;SfiⅠ酶10 μL;100×BSA 1 μL;混用后50℃孵育2 h，孵育后加入2 μL φ為1%二甲苯氰混勻.

1.2.4 cDNA的分級(jí)分離按試劑盒說明書要求準(zhǔn)備好16個(gè)1.5 mL離心管及CHROMA SPIN-400分級(jí)分離柱.將柱內(nèi)基質(zhì)搖勻，消除柱內(nèi)氣泡，移除底蓋使柱內(nèi)緩沖液流盡.加入過柱緩沖液700 μL使其自然流盡.將混有二甲苯氰的cDNA加入到柱中，待cDNA滲入基質(zhì)后加入過柱緩沖液100 μL.待自然流盡后加入過柱緩沖液600 μL，將制備好的16個(gè)離心管迅速放在柱下方，每管1滴，直到緩沖液流盡為止.每管取3 μL進(jìn)行11 g/L瓊脂糖凝膠電泳，150 V電泳10 min.選擇符合試驗(yàn)要求的3～4管，收集到新的離心管中.加入醋酸鈉(3 mol/L;pH 4.8)1.6 μL，糖原(20 mg/mL)1.3 μL，φ為95%乙醇溶液(-20℃) 408 μL，-20℃冰浴過夜.14 000 r/min離心20 min，小心移除上清后用去離子水7 μL重懸沉淀.

1.2.5 cDNA克隆入TriplEx2載體為保證目的片段與載體更好地連接，本試驗(yàn)設(shè)立3個(gè)連接反應(yīng)梯度(表1)，以建立最優(yōu)的連接效率.

表1 梯度連接反應(yīng)Tab.1 Ligations using three different ratios of cDNA to phage vector

1.2.6 包裝反應(yīng)3個(gè)連接產(chǎn)物分別用EPICENTR公司的MaxPlaxTMLambda packaging extracts包裝，體外包裝方法按試劑盒說明書執(zhí)行，所得混合液即為原始cDNA文庫.

1.2.7 文庫質(zhì)量的鑒定1)文庫滴度的檢測：取1 μL包裝好的連接產(chǎn)物，用1×Lambda dilution buffer按1∶100稀釋.取稀釋產(chǎn)物10 μL，加入過夜培養(yǎng)的XL1-Blue 200 μL，37℃條件培養(yǎng)15 min.之后加入3 mL熔化的LB/MgSO4頂層瓊脂培養(yǎng)基，快速混勻并倒在37℃預(yù)熱的90 mm LB/MgSO4平板上，快速旋轉(zhuǎn)平板使頂層瓊脂培養(yǎng)基均勻分布在平板上.37℃條件培養(yǎng)6～18 h，每2 h觀察1次噬菌斑生長情況.

2)文庫重組率的檢測：應(yīng)用藍(lán)白斑篩選鑒定文庫重組率，在3 mL熔化的LB/MgSO4頂層瓊脂培養(yǎng)基中加入IPTG(0.1 mol/L)50 μL，X-Gal(0.1 mol/L)50 μL，根據(jù)噬菌斑數(shù)量計(jì)算文庫滴度及重組率.

3)文庫插入片段大小的檢測：隨機(jī)挑取培養(yǎng)皿中的噬菌斑進(jìn)行菌液PCR.PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃1 min，55℃30 s，72℃2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min.反應(yīng)結(jié)束后取5 μL進(jìn)行11 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測.通過電泳篩選陽性克隆，送北京三博遠(yuǎn)志公司測序.

1.2.8 序列分析利用NCBI的VecScreen程序?qū)λ鶞y序列進(jìn)行識(shí)別，去除載體，利用DNAStar軟件SeqMan程序做多序列聚類比對，將獲得的EST序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及mRNA的純化

本研究利用RNAiso Plus試劑盒提取大豆花芽總RNA，經(jīng)φ為1%甲醛變性凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖1)表明：本研究提取的吉農(nóng)18突變體材料總RNA中28.0 s、18.0 s和5.8 s條帶清晰，28.0 s條帶亮度基本上是18.0 s條帶亮度的2倍，并且條帶清晰，說明所提取的RNA完整性較好，質(zhì)量較高.經(jīng)NanoDrop(ND-1000)Spectrophotometer測定其在230、260及280 nm處的吸收值(D)，結(jié)果顯示其D260nm/D280nm均在1.8～2.0之間，D260nm/D230nm均在2.2～2.6之間，RNA質(zhì)量濃度為219～324 ng/μL，說明蛋白質(zhì)及鹽類等污染較小，所提RNA純度較高，達(dá)到反轉(zhuǎn)錄所需RNA濃度，符合構(gòu)建cDNA文庫的要求.

圖1 吉農(nóng)18大豆花芽突變體總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA from flower bud mutants of soybean Jinong 18

2.2 雙鏈cDNA的合成

取5 μL雙鏈cDNA經(jīng)11 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，從圖2中可以看出，cDNA條帶基本在0.5～2.0 kb間彌散，且集中在0.75～1.00 kb之間，中間有幾條與組織特異性高豐度mRNA相對應(yīng)的亮帶，結(jié)果表明雙鏈cDNA合成符合文庫構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn).

圖2 吉農(nóng)18大豆花芽突變體雙鏈cDNA電泳圖Fig.2 Electrophoresis of ds cDNA from flower bud mutants of soybean Jinong 18

2.3 cDNA的分級(jí)分離

雙鏈cDNA合成后通過蛋白酶K的消化和SfiⅠ酶切后，用CHROMA SPIN-400柱分級(jí)分離，將引物及小片段cDNA(＜0.5 kb)過濾掉.經(jīng)11 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖3)表明：16管中1～4號(hào)管、9～16號(hào)管沒有條帶，5～8號(hào)管有清晰的、大小為500～2 000 bp的條帶，根據(jù)文庫構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)，收集大小在500～2 000 bp之間的條帶，因此，本研究收集5～8號(hào)的離心管用于后續(xù)文庫構(gòu)建.

2.4 cDNA文庫質(zhì)量的檢測

2.4.1 cDNA克隆入λTriplEx2載體和庫容量的檢測按照不同比例，設(shè)置3個(gè)cDNA與載體的連接反應(yīng)，包裝后侵染E.coliXL1-Blue菌株，觀察噬菌斑的數(shù)量，并計(jì)算噬菌體滴度，選擇最佳的連接效率.未擴(kuò)增文庫滴度測試結(jié)果見表2.

圖3 吉農(nóng)18大豆花芽突變體cDNA片段分級(jí)分離電泳圖Fig.3 Electrophoresis of cDNA size of fractionation from flower bud mutants of soybean Jinong 18

表2 未擴(kuò)增文庫滴度測試結(jié)果Tab.2 Results of an unamplified library titer test

經(jīng)檢測，原始文庫滴度為1.3×106pfu/mL，重組率為93.6%.擴(kuò)增文庫的滴度為2.13×108pfu/mL，重組率為95.3%.重組率大于80%，文庫滴度大于1.0×106pfu/mL的文庫即為合格文庫，因此本研究所構(gòu)建的文庫為合格的cDNA文庫.

2.4.2 文庫插入片段大小的檢測從文庫中隨機(jī)挑取30個(gè)單克隆，進(jìn)行菌落PCR檢測.檢測結(jié)果(圖4)表明，挑取的30個(gè)克隆均出現(xiàn)清晰條帶，條帶的分布主要集中在0.75～2.00 kb之間.其中，0.20～0.50 kb間有1個(gè)克隆，占總克隆數(shù)的3.3%;0.50～0.75 kb間有7個(gè)克隆，占總克隆數(shù)的23.3%，0.75～1.00 kb間有12個(gè)克隆，占總克隆數(shù)的40.0%;1.00～2.00 kb間有10個(gè)克隆，占總克隆數(shù)的33.3%;平均長度為1.0 kb左右.進(jìn)一步檢測結(jié)果證明，本研究構(gòu)建的大豆花芽cDNA文庫完全滿足cDNA文庫構(gòu)建的庫容要求.

圖4 吉農(nóng)18大豆花芽突變體cDNA文庫中插入片段大小凝膠電泳圖Fig.4 Electrophoresis of inserts in the library from flower bud mutants of soybean Jinong 18 by PCR

2.5 測序及EST分析

從cDNA原始文庫中隨機(jī)挑取53個(gè)克隆進(jìn)行測序，利用NCBI的VecScreen程序?qū)λ鶞y序列進(jìn)行識(shí)別，去除載體序列、短序列和低相對分子質(zhì)量序列后共獲得有效序列42條，有效序列大小在117～523 bp之間，其中序列大小為100～200 bp的有9條，占總數(shù)的21.4%;200～300 bp的有16條，占總數(shù)的38.1%; 300～400 bp的有13條，占總數(shù)的31.0%;400～500 bp的有3條，占總數(shù)的7.1%;500～600 bp的有1條，占總數(shù)的2.4%.利用Phrap程序進(jìn)行多序列聚類拼接，獲得23個(gè)非重復(fù)序列，將獲得的EST序列利用NCBI的BlastX進(jìn)行相似性的比對分析，結(jié)果如表3.

表3 功能已知ESTs的比對結(jié)果(BlastX)Tab.3 The results(BlastX)for a comparison between homology and function genes deposited in GenBank

3 討論

3.1 大豆花芽cDNA文庫質(zhì)量評價(jià)

評價(jià)cDNA文庫的質(zhì)量主要包括2個(gè)方面：一是cDNA文庫的代表性，即mRNA的種類，它可以用一個(gè)量化的標(biāo)準(zhǔn)來衡量，就是cDNA文庫的庫容量［11］.本試驗(yàn)構(gòu)建的原始cDNA文庫的滴度為1.3×106pfu/mL，一般文庫滴度要求不小于1.0×106pfu/mL.與目前已經(jīng)構(gòu)建的全長cDNA文庫相比較，董志敏等［12］構(gòu)建的大豆葉片全長cDNA文庫原始滴度為2.13×108pfu/mL;房學(xué)爽等［13］構(gòu)建的珙桐葉片cDNA文庫原始滴度為6.3×106pfu/mL.由此可證明本試驗(yàn)所構(gòu)建的cDNA文庫可以滿足大規(guī)模測序所需.二是重組cDNA片段序列的完整性，即重組的cDNA片段足夠長，可以反映出基因的天然結(jié)構(gòu).本試驗(yàn)所構(gòu)建的cDNA文庫的插入片段在0.5 kb以上的占96.6%，平均長度在1.0 kb左右，表明本試驗(yàn)獲得了較高比率的全長cDNA.

3.2 SMART法全長cDNA文庫的構(gòu)建

cDNA文庫的建立，可以獲得更多擁有優(yōu)良性狀的基因，cDNA文庫的質(zhì)量決定了是否能獲得全長的cDNA克?。?4-15］.構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫的先決條件是高質(zhì)量、高純度的RNA.以往常用的cDNA合成方法中，都要有足夠的試驗(yàn)材料來提取高純度的mRNA，而SMART技術(shù)彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)，可以直接利用總RNA來合成cDNA［16-17］，并且起始材料用量較少，使用0.05～1.00 μg的總RNA就可以利用LDPCR技術(shù)構(gòu)建雙鏈cDNA，獲得一個(gè)大于106 pfu的全長cDNA文庫，對于稀有材料而言具有較高的應(yīng)用價(jià)值［12，18］.通過LD-PCR的方法，避免了當(dāng)mRNA內(nèi)部存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，或是mRNA長度過長時(shí)不能反轉(zhuǎn)錄完全的現(xiàn)象發(fā)生.LD-PCR擴(kuò)增中使用的聚合酶混合物包含N-末端缺失突變的Taq酶、具有3'、5'端矯正功能的聚合酶以及特有的用于自然熱啟動(dòng)的抗體，使合成的cDNA提高了精確度和高效性.cDNA通過分級(jí)分離后，過濾掉了較小的cDNA片段和酶切反應(yīng)后DNA片段的殘留物，不僅保證了大片段cDNA的富集，還減少了后期篩選的工作量［19］.SMART技術(shù)中提供的SfiⅠ酶含有2個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，可保證cDNA以正確的方向連接到載體中，提高了表達(dá)的機(jī)率.在進(jìn)行SfiⅠ酶切反應(yīng)時(shí)，要注意控制酶的用量，酶的濃度過大可能使酶產(chǎn)生信號(hào)活性，酶的體積過低會(huì)明顯抑制酶的活性［20］.本試驗(yàn)構(gòu)建庫試劑盒中所提供的載體為噬菌體，利用該載體構(gòu)建的cDNA文庫庫容量大，可以篩選出低豐度的mRNA，而通過質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫包含的克隆數(shù)較少，只能篩選出高豐度的mRNA，因此考慮到大豆中可能含有低豐度的mRNA的情況，因此選擇λ噬菌體為載體進(jìn)行連接反應(yīng)可保證構(gòu)建文庫的質(zhì)量.將制備好的cDNA克隆到載體中，通過平行試驗(yàn)決定插入片段和載體的最佳比例，一般推薦的二者之比在2～5之間，如果比值較大會(huì)直接降低連接效率，比值過小容易使DNA造成自連.此外，SMART技術(shù)提供的噬菌體臂中包含LacZ和Ampr2個(gè)篩選基因，以不同的讀碼框架通過插入?yún)^(qū)，從而增加了插入?yún)^(qū)基因的表達(dá)概率，并且可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，提高了產(chǎn)生高滴度文庫的機(jī)率［21］.

3.3 EST分析

目前，大豆花芽的遺傳規(guī)律研究較少，本研究經(jīng)初步測序獲得了一些關(guān)于初級(jí)代謝、蛋白質(zhì)合成的相關(guān)基因.后期研究將通過雙向測序、Primer walking測序等手段，完成部分基因的全長cDNA的獲得，在后續(xù)的研究中，如果通過上述方法還是不能獲得全長cDNA的少數(shù)基因，可通過文庫雜交等方法獲得.

致謝：感謝吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心對本研究的支持和幫助!

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【責(zé)任編輯周志紅】

Construction and quality analysis of cDNA library from flower buds of spring soybean cultivars

WANG Nan1，ZHOU Ying1，YAO Dan2，YIN Junqi1，QU Jing1，WANG Piwu1
(1 College of Agronomy，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China; 2 College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

【Objective】To understand soybean pods and multigrain gene regulation mechanisms of improving soybean production，a soybean flower bud cDNA library was constructed.The quality of library construction was initially identified according to the requirements.【Method】In order to study the novel genes from flower bud mutants of soybean，a full-length cDNA library from flower bud mutants of soybean Jinong 18 was constructed.Total RNA from young flower bud mutants of soybean was extracted.Double strand cDNA was synthesized by SMART method.After proteinase K digestion andSfiⅠdigestion，the ds cDNA fragments were ligated to the λTriplEx vector.A cDNA library of soybean was successfully constructed.【Result and conclusion】With the unamplified library stored after amplification，the titer of the amplified library was estimated as 2.13×108pfu/mL and the recombination rate was approximately 95.3%.PCR results showed that the inserts varied from 0.5 to 2.0 kb with an average size of 1.0 kb or so.It indicated that this library could be used for full-length genes screening and cloning of low abundance genes.The library will lay a foundation for the genes clon and molecular biological research.

soybean;flower bud;cDNA library construction;quality analysis

Q 785;S336

A

1001-411X(2014)01-0073-06

王楠，周瑩，姚丹，等.春大豆花芽cDNA文庫的構(gòu)建及質(zhì)量分析［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(1)：73-78.

2013-01-24優(yōu)先出版時(shí)間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1610.014.html

王楠(1987—)，女，碩士，E-mail:759774740qq.com;通信作者:王丕武(1958—)，男，教授，博士，E-mail: peiwuw@yahoo.com.cn

吉林省科技支撐重點(diǎn)項(xiàng)目(20090203);吉林省發(fā)改委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(20090001)