高艷，岳靜，黃顯會，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學，國家獸藥殘留基準實驗室，廣東廣州 510642)

林可霉素-大觀霉素注射液在豬體內(nèi)的殘留消除研究

高艷，岳靜，黃顯會，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學，國家獸藥殘留基準實驗室，廣東廣州 510642)

【目的】對一種鹽酸林可霉素-硫酸大觀霉素注射液在豬組織中的殘留消除進行研究，并制訂該制劑在豬體內(nèi)的休藥期.【方法】常規(guī)飼養(yǎng)條件下，將30頭健康豬隨機分為6組，按豬體質(zhì)量以15 mg/kg(即林可霉素5 mg/kg和大觀霉素10 mg/kg)劑量頸部肌內(nèi)注射鹽酸林可霉素-硫酸大觀霉素注射液，每天1次，連用5 d，于最后一次給藥后8、24、72、144、240、336 h各宰殺1組豬，分別采集每頭豬的肌肉、肝臟、腎臟、脂肪和注射位點5種組織，采用LC-MS/MS法和HPLC-UV法分別對林可霉素和大觀霉素進行殘留量測定.【結(jié)果和結(jié)論】林可霉素在豬組織中消除較快，大觀霉素消除較慢，給藥后第6天所有檢測組織中的林可霉素和大觀霉素已全部低于最高殘留限量，林可霉素和大觀霉素在豬體內(nèi)各組織器官的殘留濃度大小順序均為：腎臟＞肝臟＞注射部位＞肌肉＞脂肪，表明腎臟是二者的靶組織.結(jié)合農(nóng)業(yè)部規(guī)定的林可霉素、大觀霉素在豬體內(nèi)的最高殘留限量和WT1.4休藥期軟件計算結(jié)果，建議該制劑在豬體內(nèi)的休藥期為8 d.

殘留;豬;林可霉素;大觀霉素

林可霉素為林可胺類抗生素，主要抗革蘭陽性菌，大觀霉素為氨基糖苷類抗生素，主要抗革蘭陰性菌，兩者聯(lián)用可從不同環(huán)節(jié)阻礙細菌蛋白質(zhì)的合成，具有較好的協(xié)同作用.林可霉素與大觀霉素配伍常用于防治豬沙門菌病、支原體肺炎和敏感菌引起的母豬乳腺炎-子宮炎-無乳綜合癥等疾病，臨床上還可用于治療豬密螺旋體性痢疾［1］.隨著該復方制劑在畜牧業(yè)中的廣泛使用，不可避免地引起動物組織或其產(chǎn)品中藥物的滯留或蓄積，不僅影響了動物性產(chǎn)品的生產(chǎn)加工，而且還會以殘留的方式進入人體和生態(tài)系統(tǒng)，嚴重影響消費者的身體健康［2］.本文對一種鹽酸林可霉素-硫酸大觀霉素注射液在豬組織中的殘留消除進行研究，旨在為臨床上合理使用該制劑提供理論依據(jù)和指導，并為制訂該制劑在豬體內(nèi)的休藥期和正確執(zhí)行休藥期的規(guī)定提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

15 %鹽酸林可霉素-硫酸大觀霉素注射液(其中含林可霉素50 mg/mL，大觀霉素100 mg/mL)，批號120614，由上海公誼獸藥廠提供.Bond Elut C18固相萃取小柱(6 mL，500 mg)，美國安捷倫公司.甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，正己烷(分析純)，二氯甲烷(分析純)等.水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水.

1.2 主要溶液配制

提取液：稱取磷酸二氫鉀1.36 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0，加入三氯乙酸20 g溶解即得.

十二烷基磺酸鈉溶液：稱取十二烷基磺酸鈉2.78 g，加水溶解并稀釋至50 mL，靜置24 h后備用.

十二烷基磺酸鈉緩沖液：稱取十二烷基磺酸鈉2.78 g，用水溶解，加入乙酸1 mL，并用水稀釋至500 mL.

1.3 儀器

美國應用生物系統(tǒng)公司API4000型串聯(lián)質(zhì)譜儀(配ESI離子源).戴安UltiMate 3000高效液相色譜儀(配四元泵、自動進樣器、柱溫箱等).德國Eppendorf公司高速離心機.色譜柱：Hypersil BDS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，大連伊利特分析儀器有限公司.超聲機：HS10260D型，BENCHTOP公司.

1.4 動物試驗流程

32 頭健康豬，其中，2頭為空白對照，其余的隨機分為6組.按豬體質(zhì)量以15 mg/kg(林可霉素5 mg/kg和大觀霉素10 mg/kg)劑量頸部肌內(nèi)注射鹽酸林可霉素-硫酸大觀霉素注射液，每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d，分別在給藥后第8、24、72、144、240、336小時的時間點各宰殺1組豬，采集肌肉、肝臟、腎臟、脂肪及注射位點等5種組織，做好標記、包裝，保存于-20℃冰箱，待測.

1.5 組織樣品前處理

1.5.1 含林可霉素的樣品前處理準確稱取勻質(zhì)試樣(肌肉和脂肪各1 g，肝臟和腎臟各0.5 g)，置于15 mL離心管中，加入2 mL乙腈渦旋混勻，超聲10 min，振蕩10 min，于4℃條件下8 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，殘渣用1 mL乙腈重復提取1次，合并上清液，蒸餾水稀釋至10 mL.用4 mL正己烷除脂3次，8 000 r/min離心10 min，棄正己烷層，水層過0.22 μm濾膜，進行LC-MS/MS測定.

1.5.2 含大觀霉素的樣品前處理含大觀霉素的樣品前處理過程包括提取、凈化和衍生化.其中，提取和凈化過程參照我國農(nóng)業(yè)部已頒布的動物性食品中林可霉素和大觀霉素殘留檢測氣相色譜法(農(nóng)業(yè)部1163號公告-2-2009);衍生化過程如下：洗脫液用氮氣吹干，加100 μL水復溶，加入400 μL體積分數(shù)為6%的三氟乙酸-乙腈溶液和400 μL 5 mg/mL 2，4-二硝基苯肼-乙腈溶液，渦旋混勻，70℃衍生化1 h，取出，冰浴2 min，加入100 μL丙酮，混勻后于70℃加熱10 min終止反應，冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜，進行HPLC測定.

1.6 檢測林可霉素和大觀霉素的色譜條件

1.6.1 檢測林可霉素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件液相色譜條件：色譜柱：Hypersil GOLD C18(5 μm，150 mm×2.1 mm);流速：0.25 mL/min;柱溫：35℃;進樣量：5.00 μL;流動相：A為體積分數(shù)0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈;洗脫梯度：流動相B的比例在1.5 min內(nèi)由4%線性提高到85%，然后保持4 min，再在0.5 min內(nèi)降至4%，柱平衡時間6 min.

質(zhì)譜條件：ESI+離子化模式;霧化氣壓力(GS1)：344 kPa;輔助氣壓力(GS2)：241 kPa;氣簾氣壓力(CUR)：68 kPa;噴霧電壓(IS)：5 500 V;離子源溫度：650℃.

1.6.2 檢測大觀霉素的高效液相色譜條件檢測器：紫外檢測器，檢測波長500 nm;色譜柱：Hypersil BDS C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);流動相：乙腈-四氫呋喃-水(體積比30∶35∶35);流速為1 mL/min;柱溫30℃;進樣量：50 μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

在本試驗色譜條件下，林可霉素和大觀霉素與組織中其他組分分離良好，色譜峰峰形較佳，林可霉素在豬肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中的檢測限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg，保留時間6.5 min左右，大觀霉素在各組織中的檢測限均為50 μg/kg，定量限為100 μg/kg，保留時間8.2 min左右.林可霉素在豬不同組織中的線性范圍為1～200 ng/mL，大觀霉素在豬不同組織中的線性范圍為0.1～10 μg/g，相關系數(shù)均在0.99以上，線性關系良好.林可霉素在豬不同組織中的回收率為70.00%～106.20%，批內(nèi)變異系數(shù)為3.57%～11.18%，批間變異系數(shù)為4.13%～10.42%.大觀霉素在豬不同組織中的回收率為85.64%～99.38%，批內(nèi)變異系數(shù)為3.12%～6.17%，批間變異系數(shù)為4.09%～7.19%.

2.2 組織中藥物殘留

將冷凍保存組織樣品自然解凍，依據(jù)上述建立的方法，對試驗組豬在不同屠宰時間點采集的肌肉、肝臟、腎臟、脂肪及注射位點5種組織進行測定，以測得的組織樣品藥物峰面積代入標準曲線計算出藥物殘留量.結(jié)果見表1.

表1 豬肌注鹽酸林可霉素-硫酸大觀霉素注射液后組織中平均殘留量1)Tab.1 Mean residues in tissues after intramuscular administration of lincomycin hydrochloride-spectinomycin sulfate injection in pigs

2.3 數(shù)據(jù)處理

我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的林可霉素在豬組織中的最高殘留限量為肌肉、脂肪100 μg/kg，肝臟500 μg/kg，腎臟1 500 μg/kg;大觀霉素在豬組織中的最高殘留限量為肌肉500 μg/kg，脂肪、肝臟2 000 μg/kg，腎臟5 000 μg/kg.經(jīng)WT1.4休藥期軟件處理藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，計算得到林可霉素在各組織的休藥期分別為：肌肉24 h、肝臟24 h、腎臟61.69 h、注射位點為42.26 h、脂肪24 h;大觀霉素在豬各組織的休藥期分別為：肌肉34.61 h、肝臟54.44 h、腎臟176.62 h、注射位點為67.58 h、脂肪8 h.根據(jù)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的最高殘留限量標準及上述分析結(jié)果，可知該制劑以15 mg/kg肌注(每天1次，連用5 d)時在豬體內(nèi)的休藥期為8 d.

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測方法

先前報道的關于大觀霉素的檢測方法有高效液相色譜-電化學檢測法［3-5］，高效液相色譜-安培檢測法［6］，高效液相色譜-柱前/柱后衍生化法，薄層色譜分析法/密度測定法［7］，以及氣相色譜分析法［8-10］.本研究中，大觀霉素的檢測采用的是高效液相色譜柱前衍生化法，選取2，4-二硝基苯肼作為衍生化試劑，該試劑可與大觀霉素的羰基反應生成苯腙化合物二硝基苯肼-大觀霉素［11］，衍生過程及衍生產(chǎn)物均比較穩(wěn)定.反應需在酸性條件下進行，故用三氟乙酸控制反應過程中的酸性條件.已報道三氟乙酸-乙腈溶液的體積分數(shù)有3%［12］和6%［11］，通過比較發(fā)現(xiàn)體積分數(shù)為6%的三氟乙酸-乙腈溶液作為酸性條件控制反應過程時效果較好，因此本研究中大觀霉素的衍生化反應采用體積分數(shù)為6%的三氟乙酸-乙腈溶液.此外，也有報道采用反相高效液相色譜法測定林可霉素在腎臟、肝臟、肌肉和牛奶中的殘留［13］，離子對反相高效液相色譜法測定林可霉素在鮭魚肌肉和皮膚中的殘留［14］，但是這些方法都涉及到繁瑣的樣品提取及凈化程序.Sin等［13］報道了使用液相色譜電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法測定林可霉素在動物組織和牛奶中的殘留，該方法準確、精確、靈敏，且樣品制備過程簡單.基于此，本研究依據(jù)實驗室的實際狀況對該方法進行了優(yōu)化，用于測定林可霉素在豬組織的含量.

3.2 殘留消除及休藥期

林可霉素和大觀霉素在豬組織中均以腎臟的殘留量最高，其次是肝臟、注射位點、肌肉、脂肪，因此，腎臟是該2種藥物在豬體內(nèi)的靶組織.諸多對林可霉素在豬和雞體內(nèi)殘留和消除規(guī)律研究表明，林可霉素在肝臟和腎臟中的殘留量最高，其次為肌肉和脂肪;對大觀霉素在畜禽體組織殘留和消除規(guī)律研究表明，大觀霉素在腎臟的殘留量最高，其次為肝臟，肌肉和脂肪的殘留量較低.Hornish等［16］利用原子示蹤技術研究了給豬連續(xù)3 d飼喂含不同水平林可霉素的飼料，結(jié)果表明，林可霉素在肝臟及腎臟中的殘留量遠高于肌肉和脂肪中，但其消除速度很快.Hornish等［16］對豬和肉雞的研究均證明，豬、雞組織中林可霉素的殘留量與飼料中林可霉素的濃度呈強線性相關.因此，在實際應用中，超量添加可導致林可霉素在動物性食品中殘留超標.Bergwerff等［17］的研究也證實了腎臟中大觀霉素的殘留量最高.

獸藥使用指南規(guī)定鹽酸林可霉素硫酸大觀霉素可溶性粉和預混劑在豬體內(nèi)的休藥期為5 d［18］，但并未對復方注射液作出具體規(guī)定.根據(jù)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的林可霉素和大觀霉素的最高殘留限量和WT1.4休藥期軟件的計算結(jié)果，建議該制劑按豬體質(zhì)量以15 mg/kg肌注(每天1次，連用5 d)時的休藥期為8 d.

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【責任編輯柴焰】

Residue depletion of lincomycin hydrochloride-spectinomycin sulfate injection in pigs

GAO Yan，YUE Jing，HUANG Xianhui，ZENG Zhenling
(National Reference Laboratory Veterinary Drug Residues，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

【Objective】The residue depletion of lincomycin hydrochloride-spectinomycin sulfate injection in pigs was investigated in this study，and its withdrawal time was estimated.【Method】In routine breeding conditions，thirty healthy pigs were randomly allocated to six treatment groups.All of them were treated with lincomycin hydrochloride-spectinomycin sulfate injection at a dosage of 15 mg/kg(5 mg lincomycin and 10 mg spectinomycin)once daily for 5 consecutive days.Five medicated pigs were slaughtered at 8，24，72，144，240 and 336 h after intramuscular administration，and muscle，liver，kidney，fat and injection site tissues were sampled.The tissue concentration of lincomycin and spectinomycin was analyzed respectively by liquid chromatography-mass spsectrometry(LC-MS/MS)and high-performance liquid chromatography(HPLC).【Result and conclusion】At 6 days postmedication，all observations of spectinomycin and lincomycin were below the corresponding MRLs.In all of the detected tissues，kidney had the highest drug concentration followed by liver，injection site，muscle and fat with the lowest drug concentration，indicating that kidney was target tissue for spectinomycin and lincomycin.Based on the MRLs，which were established by the Chinese Agriculture Ministry，the withdrawal time in pigs was analyzed by WT1.4 software.The results indicated that the withdrawal time of lincomycin hydrochloridespectinomycin sulfate injection should be 8 days after intramuscular administration of 15 mg/kg in pigs.

residue;pig;lincomycin;spectinomycin

S859.79

A

1001-411X(2014)01-0106-04

高艷，岳靜，黃顯會，等.林可霉素-大觀霉素注射液在豬體內(nèi)的殘留消除研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014，35(1)：106-109.

2013-02-21優(yōu)先出版時間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1500.006.html

高艷(1987—)，女，碩士研究生，E-mail:501876793@qq.com;通信作者:曾振靈(1963—)，男，教授，博士，E-mail:zlzeng@scau.edu.cn

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(201303038-5);廣東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2012NL018)