萬麗，蹇華麗，胡葉，楊幼慧

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642)

模擬荔枝酒體系中兒茶素非酶褐變的研究

萬麗?，蹇華麗?，胡葉，楊幼慧

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642)

【目的】研究4種有機酸、pH、SO2以及金屬離子Cu、Fe對荔枝酒貯藏期間非酶氧化褐變的影響.【方法】在模擬荔枝酒體系加速褐變條件下，研究酚類物質(zhì)兒茶素的變化.【結(jié)果和結(jié)論】在模擬荔枝酒體系中，酒石酸和金屬離子能夠加劇非酶褐變的反應(yīng)過程，其中Fe3+與模擬酒的褐變呈極顯著的正相關(guān)，Y=0.179X-0.009X2，R2= 0.990.SO2添加量在40 mg/L以上時能在一定程度上延緩非酶褐變的發(fā)生，而當pH在3.2～4.0時，調(diào)整pH對抑制或延緩褐變效果不明顯.

模擬荔枝酒;非酶褐變;兒茶素

1 材料與方法

1.1 儀器

UVmini-1240型分光光度計，HPLC-1525-2414-2487(美國Waters公司)，水浴鍋，PB-10酸度計等.

1.2 試劑

(+)-兒茶素(質(zhì)量分數(shù)為98%)，美國Sigma公司;乙腈(色譜純)，安徽時聯(lián);甲酸(色譜純)，天津科密歐;其余試劑均為分析純試劑，廣州化學(xué)試劑廠.

1.3 試驗方法

1.3.1 模擬酒溶液的配制及加速褐變處理用于配制模擬酒的玻璃瓶及試管等用體積分數(shù)為10%的硝酸浸泡16 h，再用去離子水沖洗干凈后備用.用去離子水配制乙醇水溶液(體積分數(shù)為13%)，分別加入SO2、有機酸及金屬鹽、適量的兒茶素(100 mg/L)，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至3.8.將配制好的模擬酒按50%體積密封于螺口試管中，放于(55±0.2)℃水浴鍋中避光加熱［6］.試驗周期為8 d，每隔48 h取樣，置于4℃條件下冷藏，供后續(xù)分析，所有試驗均做3組平行.

1.3.2 褐變指數(shù)(D420nm)的測定采用分光光度計法：用1 cm比色皿，以蒸餾水為參比，在420 nm波長下，使用分光光度計測定其光密度(D420nm).用光密度的大小直接表示非酶褐變的褐變指數(shù)［7］.

1.3.3 平均聚合度(mDP)的測定兒茶素作為原花青素類物質(zhì)的單體之一，褐變后主要以聚合產(chǎn)物的形式存在，其平均聚合度可利用測定出的質(zhì)量和物質(zhì)量濃度求出［8］，計算公式如下：

其中：M為兒茶素的摩爾質(zhì)量(g/mol);ρB為原花青素的質(zhì)量濃度;cB為原花青素的物質(zhì)量濃度.質(zhì)量濃度的測定參考魏冠紅［9］的鹽酸-香草醛乙醇法，物質(zhì)量濃度的測定參考Butler等［8］的硫酸-香草醛乙酸法.

1.3.4 HPLC色譜條件參考鐘慧臻等［10］的方法略作調(diào)整.色譜柱：Purospher STAR LP RP18，4.6 mm× 250 mm，5μm;檢測波長：280 nm，440 nm;柱溫：35℃;流速：1.0 mL/min;進樣量：10 μL;流動相：流動相A為體積分數(shù)為100%的乙腈，流動相B為體積分數(shù)為0.4%的甲酸水溶液;梯度洗脫程序：0～40 min，5%～25%A;40～45 min，25%～35%A;45～50 min，35%～50%A.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機酸對模擬酒體系非酶褐變的影響

2.1.1 單一有機酸對模擬酒體系非酶褐變的影響

荔枝果肉中主要含有蘋果酸、酒石酸、檸檬酸和琥珀酸等，其中蘋果酸含量最高［11-14］.在荔枝酒釀造過程中，為保證發(fā)酵安全，需對荔枝汁進行調(diào)酸，同時酵母的代謝也影響著有機酸的含量.為了研究上述4種有機酸對模擬酒褐變的影響，本研究在各模擬酒溶液中分別添加蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸5 g/L，SO280 mg/L，F(xiàn)e2+5 mg/L(以FeSO4形式添加)，經(jīng)加速褐變處理，各模擬酒樣的褐變指數(shù)(D420nm)和mDP變化情況見圖1.

圖1 不同有機酸對模擬酒體系D420nm和mDP的影響Fig.1 Effects of organic acids on D420nmand mDP of simulated litchi wine

由圖1a可以看出，隨著加速褐變時間的延長，添加酒石酸和琥珀酸的模擬酒的D420nm增加較快，而添加蘋果酸和檸檬酸的模擬酒的D420nm變化不明顯，在加速褐變第8天，添加酒石酸、琥珀酸模擬酒的D420nm與添加蘋果酸、檸檬酸的D420nm差異達極顯著(P＜0.01);圖1b表明：添加酒石酸的模擬酒的mDP顯著增大，與其余組差異達顯著水平(P＜0.05)，剩余幾組的mDP在加速褐變試驗過程中變化較小.

2.1.2 不同酒石酸與檸檬酸比例對模擬酒體系非酶褐變的影響分別配制含酒石酸(5 g/L)、檸檬酸(5 g/L)的模擬酒溶液，按1∶0、0∶1、1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1的體積比混合，經(jīng)加速褐變處理后，其D420nm和mDP變化情況見圖2.

圖2 酒石酸與檸檬酸的比例對模擬酒體系D420nm和mDP的影響Fig.2 Effects of different proportions of tartaric acid and citric acid on D420nmand mDP of simulated litchi wine

由圖2可知，隨著加速褐變時間的延長，不同酒石酸與檸檬酸配比的模擬酒其D420nm和mDP差異明顯.在加速褐變第8天，只添加酒石酸的組別與其余組D420nm和mDP差異極顯著(P＜0.01)，而隨著酒石酸含量降低，D420nm和mDP的增幅也趨緩.這表明酒石酸的含量對兒茶素的氧化褐變有較大的影響，在一定范圍內(nèi)，酒石酸含量越高，褐變程度越嚴重.

2.2 不同pH對模擬酒體系非酶褐變的影響

考慮到荔枝酒生產(chǎn)過程中涉及的pH區(qū)間范圍，模擬酒添加酒石酸5 g/L、SO280 mg/L、Fe2+3 mg/L后，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH分別至3.2、3.5、3.8和4.0，經(jīng)加速褐變處理，其D420nm和mDP變化情況見圖3.

圖3 不同pH對模擬酒體系D420nm和mDP的影響Fig.3 Effects of pH on D420nmand mDP of simulated litchi wine

隨著加速褐變時間的延長，不同pH的模擬酒D420nm和mDP雖不斷增加(圖3)，但不同水平間差異不顯著(P＞0.05)，說明在pH 3.2～4.0間，通過調(diào)整pH并不能達到抑制或延緩褐變的目的.

2.3 不同SO2添加量對模擬酒體系非酶褐變的影響

在各模擬酒溶液中添加酒石酸5 g/L、Fe2+3 mg/L，再分別添加SO240、80、120 mg/L，以未添加SO2為對照(CK)，經(jīng)加速褐變處理，其D420nm和mDP變化情況見圖4.

由圖4可知，在加速褐變的前期，未添加SO2的對照組其D420nm顯著高于其余組(P＜0.05);隨著加速褐變的時間延長，到褐變的第8天添加SO280和120 mg/L的模擬酒D420nm顯著高于40 mg/L和對照組(P＜0.05)，且80 mg/L添加量的D420nm最高;mDP的變化雖不如D420nm明顯，但也有類似變化趨勢.說明在褐變前期SO2能有效地抑制褐變反應(yīng)，而在后期可能與SO2在褐變過程中參與的氧化還原反應(yīng)相關(guān)：在SO2含量極低的時候，從Fe2+到Fe3+的氧化可能不夠充分，從而限制了酚類物質(zhì)的金屬催化氧化的過程;SO2適量時一方面氧化金屬離子，另一方面會提高酒中酚類對氧的消耗，加劇酚類的氧化褐變［15］;而當SO2足夠多時，可部分抑制酚類物質(zhì)的氧化［16］.

圖4 不同SO2添加量對模擬酒體系D420nm和mDP的影響Fig.4 Effects of SO2on D420nmand mDP of simulated litchi wine

2.4 金屬離子對模擬酒體系非酶褐變的影響

2.4.1 不同金屬離子對模擬酒體系非酶褐變的影響在各模擬酒溶液中添加酒石酸5 g/L、SO280 mg/L，再分別添加Fe2+、Fe3+、Cu2+3 mg/L(以FeSO4、FeCl3、CuSO4形式添加)，以未添加金屬離子為對照(CK)，經(jīng)加速褐變處理其D420nm和mDP變化情況見圖5.

如圖5所示，所有添加了金屬離子的試驗組的褐變情況均顯著高于對照組(P＜0.05);其中Fe3+對褐變的影響最為突出，達極顯著水平(P＜0.01)，而添加Fe2+和Cu2+模擬酒的褐變較添加Fe3+的酒輕微，兩者之間無顯著差異(P＞0.05).說明金屬離子的催化對于酚類的褐變起到了至關(guān)重要的作用，其中Fe3+催化效率最高.

2.4.2 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度對模擬酒體系非酶褐變的影響為進一步探討Fe3+的影響，在各模擬酒溶液中分別添加Fe3+0、0.2、1.0、3.0、5.0、10.0 mg/L，經(jīng)加速褐變處理8 d后其D420nm和mDP變化情況見圖6.

圖5 不同金屬離子對模擬酒體系D420nm和mDP的影響Fig.5 Effects of different metal ions on D450nmand mDP of simulated litchi wine

圖6 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度對模擬酒體系D420nm和mDP的影響Fig.6 Effects of Fe3+on D420nmand mDP of simulated litchi wine

隨著模擬酒中Fe3+質(zhì)量濃度的增加，D420nm和mDP迅速增大(圖6)，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度與D420nm呈極顯著的正相關(guān)(P＜0.01);以模擬酒D420nm作為Y值，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為X值，經(jīng)SPSS 17.0對二者進行線性回歸分析，兩者間線性關(guān)系如下：Y=0.179X-0.009X2，R2=0.990.

2.5 模擬酒體系加速褐變處理后HPLC色譜分析

經(jīng)過紫外可見分光光度計對加速褐變處理前后的模擬酒進行吸收光譜掃描分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)加速褐變的模擬酒吸收波長除在280 nm外，在440 nm處也有較大吸收(圖7)，而未褐變的模擬酒在此處幾乎沒有吸收;同時，進行HPLC色譜分析發(fā)現(xiàn)模擬酒褐變后在440 nm的HPLC色譜峰比未褐變的模擬酒增加了一些未知峰(圖8)，其中a～e幾個峰形與相關(guān)文獻中研究結(jié)果類似，這些最大吸收波長在440 nm的物質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)為呫噸鹽(Xanthylium salts)陽離子類物質(zhì)［17］，該類物質(zhì)為原花青素單體形成的二聚物，說明該條件下模擬酒體系的褐變主要由兒茶素的氧化聚合反應(yīng)造成;而其余未知峰因未進行進一步質(zhì)譜分析難以判定其構(gòu)成.

圖7 模擬酒褐變前后吸收光譜比較Fig.7 Changes in the absorbance spectra of simulated litchi wine

圖8 模擬酒加速褐變前后HPLC色譜圖Fig.8 The HPLC chromatogram of controlled and browned simulated litchi wine

3 討論與結(jié)論

不同有機酸對模擬荔枝酒中兒茶素非酶褐變的影響有較大的差異，其中酒石酸對酚類的氧化褐變有較大的影響;SO2與酚類的氧化褐變存在先抑制后促進的關(guān)系;Fe、Cu等金屬離子對非酶褐變有催化作用，其中Fe3+離子的催化作用最強，且催化褐變的程度與其含量呈顯著的正相關(guān).Merida等［18］研究認為，引起這一現(xiàn)象的原因可能是酒石酸在金屬離子的催化作用下分解為乙醛酸，而乙醛酸在酚類聚合反應(yīng)的過程中可作為黃烷-3-醇類物質(zhì)之間的橋接，加劇聚合反應(yīng)的進程.相關(guān)研究證實，F(xiàn)e3+可催化酚類物質(zhì)氧化生成醌類和H2O2，而H2O2可進一步催化低價態(tài)金屬離子轉(zhuǎn)化為高價態(tài)，并產(chǎn)生羥基自由基，其作為強氧化劑可進一步加劇整個體系中的氧化褐變反應(yīng)［19-20］.經(jīng)HPLC色譜分析褐變后物質(zhì)也初步推斷，該條件下模擬酒體系的褐變主要由兒茶素的氧化聚合反應(yīng)造成.

在荔枝酒生產(chǎn)中，可從選擇酒石酸含量低的荔枝、控制荔枝酒中SO2添加量及金屬離子幾方面考慮工藝措施，以減少荔枝酒貯藏過程中非酶褐變的發(fā)生.

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【責任編輯李曉卉】

A study of non-enzymatic browning of(+)-catechin in a simulated litchi wine

WAN Li，JIAN Huali，HU Ye，YANG Youhui
(College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

【Objective】In order to determine the influence of organic acid，pH，SO2，copper and ferrous ion on non-enzymatic browning of litchi wine during the storage，the browning problem was studied in this paper.【Method】(+)-Catechin was investigated as representative substance in a simulated litchi wine in accelerating browning test.【Result and conclusion】It could be observed that tartaric acid，copper and ferrous iron increased the browning，in which the correlation between Fe3+and browning of simulated litchi wine was significant：Y=0.179X-0.009X2，R2=0.990.The content of SO2above 40 mg/L can delay the oxidation to some extent，while the pH adjusted between 3.2 and 4.0 has no obvious influence.

simulated litchi wine;non-enzymatic browning;(+)-catechin

TS262.7

A

1001-411X(2014)01-0100-06

萬麗，蹇華麗，胡葉，等.模擬荔枝酒體系中兒茶素非酶褐變的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，35(1)：100-105.

荔枝酒在貯藏過程中極易發(fā)生褐變，嚴重影響色澤和風味，使其感官品質(zhì)變劣.荔枝酒中的酚類物質(zhì)是引起荔枝酒褐變的主要底物，包括酶促褐變和非酶褐變.由于荔枝酒釀造期間添加SO2及采用低溫發(fā)酵，抑制了氧化酶的活性，因而主要表現(xiàn)為非酶褐變［1］.近年來研究表明，含有鄰羥基結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)在非酶氧化過程中特別重要，其中黃烷醇類，特別是黃烷-3-醇類被認為是非酶褐變中最有效的底物，且褐變主要由其聚合反應(yīng)引起［2-3］.李學(xué)偉［4］和丁娟［5］的研究表明，黃烷-3-醇類，例如(-)-表兒茶素、原花青素B2等，是引起荔枝酒非酶褐變的重要酚類物質(zhì)，引起褐變的最主要原因之一可能是黃烷-3-醇類的氧化聚合反應(yīng).由于荔枝酒中氧化褐變的反應(yīng)過程及褐變產(chǎn)物組分復(fù)雜，直接研究各類因素對其褐變的影響及褐變機理難度較大［1，4］.為探明不同因素對荔枝酒褐變的影響，本試驗以引起荔枝酒褐變的主要酚類物質(zhì)黃烷-3-醇類的代表物質(zhì)兒茶素為研究對象，采用模擬荔枝酒體系，研究有機酸、SO2、金屬離子等因素對其非酶氧化褐變的影響，為控制荔枝酒的褐變提供理論依據(jù).

2013-04-07優(yōu)先出版時間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1500.004.html

萬麗(1989—)，女，碩士研究生，E-mail:wanli7715@163.com;蹇華麗(1977—)，女，講師，博士，E-mail:hualij@ 163.com;?對本文貢獻相同;通信作者:楊幼慧(1956—)，女，教授，碩士，E-mail:yhyang@scau.edu.cn

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2012E0002005);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-33荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系)