孟凡榮 陳琛 萬海粟 周清華

體外基因定點(diǎn)突變（in vitrosite-directed mutagenesis）是分子生物學(xué)領(lǐng)域一種常用的技術(shù)手段[1-3]。目前為止，已經(jīng)報(bào)告了多種實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)突變目的的實(shí)驗(yàn)方法[4,5]。這些方法雖然各有特點(diǎn)，但大多都是利用突變引物將所需要的突變引入載體序列，也能滿足大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)要求。只是在多數(shù)情況下，待突變的序列一般都位于7 kb以下的載體上，在這些載體進(jìn)行定點(diǎn)是容易實(shí)現(xiàn)的。然而，對(duì)于長(zhǎng)的載體序列，許多方法就不適用，其中原因，一是利用突變引物做擴(kuò)增時(shí)，效率較低，二是后續(xù)實(shí)驗(yàn)中突變效率也很低。盡管有人報(bào)告了一些解決這一問題的方法[6,7]，但大多在操作上比較繁瑣。

我們最近報(bào)告一種不依賴于突變引物的實(shí)驗(yàn)方法。這種方法借助一對(duì)含有Type IIs類限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的載體引物[6-10]，以及一個(gè)含有所需要的突變的短的DNA雙鏈，實(shí)驗(yàn)利用載體引物對(duì)除突變區(qū)域外的載體序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后，利用相應(yīng)的Type IIs類的限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并與突變雙鏈進(jìn)行連接以形成突變載體[11]。該方法的突變效率接近100%。本文所描述的對(duì)長(zhǎng)載體序列進(jìn)行突變的方法，就是在這個(gè)已經(jīng)報(bào)告的方法的基礎(chǔ)上形成的。本文的實(shí)驗(yàn)，在長(zhǎng)載體序列上進(jìn)行了突變，結(jié)果表明，我們所提供的在長(zhǎng)載體序列進(jìn)行突變的方法是一個(gè)非常有效的手段和工具。

1 材料和方法

1.1 材料 本文所用的兩個(gè)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒，分別為質(zhì)粒pOCT4-Luc1和pOCT4-Luc2，兩個(gè)質(zhì)粒長(zhǎng)度均為9,613 bp，其中質(zhì)粒pOCT4-Luc2（載體序列見附錄）含有一個(gè)限制性內(nèi)切酶Esp3I的酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒pOCT4-Luc1中沒有這個(gè)酶切位點(diǎn)，其余部分序列與pOCT4-Luc2相同。 實(shí)驗(yàn)中所用材料為限制性內(nèi)切酶Esp3I和DpnI（Fermentas公司）、PCR反應(yīng)試劑（DR010A, Takara）、T4 DNA Ligase、DNA產(chǎn)物純化試劑盒（DNA Fragment Purification Kit,DV807A, TaKaRa），DH5a感受態(tài)均為大連寶生物有限公司產(chǎn)品，質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技北京有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 本文用到突變DNA雙鏈為Mutagenic fragment，所設(shè)計(jì)的引物為V-primer A, B；B-primer A1, B1；B-primer A2, B2。三對(duì)引物中均含有一個(gè)Type IIs類的限制性內(nèi)切酶，Esp3I的酶切位點(diǎn)，相應(yīng)酶切后產(chǎn)生粘性末端便于下一步驟的連接反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中所用的引物由華大基因科技服務(wù)有限公司合成，具體序列見表1。

1.2.2 突變片段及PCR產(chǎn)物的制備 人工合成的一對(duì)互補(bǔ)的突變單鏈，復(fù)性得到突變片段，此反應(yīng)在PCR儀中完成。PCR反應(yīng)所用模板為質(zhì)粒pOCT4-Luc1和pOCT4-Luc2，所用聚合酶為PrimeSTAR HS DNA Polymerase（DR010A,Takara）；引物分別為V-primer A、B-primer A1；V-primer B、B-primer B1；V-primer A、B-primer A2；V-primer B、B-primer B2。PCR反應(yīng)參數(shù)：98oC、30 s后進(jìn)入循環(huán)，98oC、10 s，62.5oC、15 s，72oC、6 min，反應(yīng)28個(gè)循環(huán)， 最后于72oC下保持20 min。所得PCR產(chǎn)物保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 模板質(zhì)粒去除 將所得PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)入37oC水浴，加入DpnI酶40 U，酶切1 h。目的是去除模板質(zhì)粒，原因是DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切[12,13]，而PCR產(chǎn)物是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物。

1.2.4 連接粘性末端的形成及連接反應(yīng) 將上一步驟所得產(chǎn)物進(jìn)行純化，所用試劑盒為DNA Fragment Purification（DV807A, Takara）。然后用限制性內(nèi)切酶Esp3I進(jìn)行酶切，形成粘性末端，反應(yīng)條件為37oC水浴2 h。再次進(jìn)行DNA純化。最后進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)條件為16oC水浴2 h，所用試劑T4 DNA Ligase（Takara）。

1.2.5 化學(xué)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒鑒定及測(cè)序 取所得連接產(chǎn)物1 μL，轉(zhuǎn)入100 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上放置30 min，42oC水浴1 min后置于冰上2 min-3 min。涂布于含amp抗生素的LB平板，37oC培養(yǎng)過夜后挑單菌落鑒定質(zhì)粒。提取質(zhì)粒使用天根質(zhì)粒小提試劑盒。所得質(zhì)粒在華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所使用的突變引物序列Tab 1 Oligonucleotides used in the experiments

2 結(jié)果

2.1 在長(zhǎng)序列中引入突變的工作流程 最近我們報(bào)告了一種不依賴于突變引物的進(jìn)行基因定點(diǎn)突變的方法。這里所描述的方法，就是在我們前期所報(bào)告的方法的基礎(chǔ)上形成的[14,15]。如圖1所示意，是在長(zhǎng)序列中引入突變的基本流程：①在待突變的區(qū)域的兩側(cè)，合成一對(duì)載體引物V-primer A和V-primer B，這一對(duì)載體引物序列中均含有一個(gè)合適的Type IIs類的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，此外，還合成兩個(gè)突變單鏈并復(fù)性融合成突變雙鏈；②選擇一個(gè)橋點(diǎn)（bridge site），橋點(diǎn)的位置，大概是距離兩個(gè)載體引物結(jié)合區(qū)的距離比較接近的區(qū)域，實(shí)驗(yàn)合成一對(duì)橋點(diǎn)引物B-primer A和B-primer B，每個(gè)橋點(diǎn)引物中也含有一個(gè)Type IIs類的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；③利用V-primer A和B-primer A配對(duì)，V-primer B和B-primer B配對(duì)，分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后，利用相應(yīng)的Type IIs類的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；④將以上酶切產(chǎn)物和突變雙鏈混合并作連接反應(yīng)以形成突變載體；⑤將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入受體菌并對(duì)所選擇的克隆進(jìn)行鑒定。在這里的實(shí)驗(yàn)程序中[16,17]，我們借助了前期報(bào)告的方法的簡(jiǎn)單和效率，又利用一個(gè)橋點(diǎn)，將長(zhǎng)的載體序列分成兩個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，這樣既解決了長(zhǎng)載體中進(jìn)行突變的效率問題，也解決了長(zhǎng)載體中進(jìn)行突變的擴(kuò)增問題。這個(gè)實(shí)驗(yàn)程序是否可用，將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 在長(zhǎng)載體中引入復(fù)雜定點(diǎn)突變 為驗(yàn)證以上實(shí)驗(yàn)程序的有效性，我們選擇了實(shí)驗(yàn)室已有的最長(zhǎng)的載體pOCT4-Luc1和pOCT4-Luc2，該載體的長(zhǎng)度為9,613 bp，遠(yuǎn)大于常見的7 kb以下的載體。此次實(shí)驗(yàn)中使用的突變片段及配對(duì)引物見圖2。以質(zhì)粒pOCT4-Luc1為例，對(duì)此實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行闡述，如圖3所示意，實(shí)驗(yàn)選擇在該載體的報(bào)告基因中，引入復(fù)雜突變片段Mutagenic fragment，其中包括了置換，刪除和插入等。我們合成了一對(duì)載體引物，V-primer A和V-primer B，這對(duì)引物中均含有一個(gè)Type IIs類的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，即Esp3I位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)選擇了一個(gè)橋點(diǎn)，該橋點(diǎn)位于載體序列中，實(shí)驗(yàn)合成了一對(duì)橋點(diǎn)引物，B-primerA1和B-primerB1，其中，每個(gè)引物中均含有一個(gè)Esp3I位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)，其中一個(gè)以V-primer A和B-primer A1為引物，而另一個(gè)則以V-primer B和B-primer B1為引物，這樣就分別獲得兩個(gè)PCR產(chǎn)物，一個(gè)長(zhǎng)度為3,387 bp，另一個(gè)長(zhǎng)度為6,188 bp；實(shí)驗(yàn)繼續(xù)借助Esp3I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，所獲得的酶切產(chǎn)物和突變片段進(jìn)行連接，就形成了所需要的突變載體1-AA1BB1。在經(jīng)過對(duì)突變克隆進(jìn)行篩選和測(cè)序鑒定后，被測(cè)序的14個(gè)克隆中，其中13個(gè)克隆含有所需要的突變，突變率達(dá)到93%。在質(zhì)粒pOCT4-Luc1中還合成了另外一對(duì)橋點(diǎn)引物來證明方法的可行性，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的兩個(gè)PCR反應(yīng)，其中一個(gè)以V-primer A和B-primer A2為引物，另一個(gè)則以V-primer B和B-primer B2為引物，這樣獲得的兩個(gè)PCR片段，一個(gè)長(zhǎng)度為4,942 bp，另一個(gè)長(zhǎng)度為4,633 bp，進(jìn)行酶切后與突變雙鏈進(jìn)行連接，構(gòu)成突變載體1-AA2BB2，突變率為90%。這個(gè)結(jié)果充分說明了我們所提供的方法的有效性。圖3具體闡述了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的流程，引物中與模板質(zhì)?；パa(bǔ)的堿基序列用下劃線標(biāo)出，PCR反應(yīng)后用限制性內(nèi)切酶Esp3I進(jìn)行酶切，暴露出粘性末端，與突變片段進(jìn)行連接反應(yīng)。突變片段中被突變的堿基用下劃線標(biāo)出。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程示意圖Fig 1 Outline the experimental procedure of our method. A pair of vector primers and a short mutagenic fragment are synthesized, each vector primers containing a type IIs class endonuclease site, simultaneously, a bridge site is selected and a pair of bridge primers is also synthesized and each of the bridges primers contains a type IIs class endonuclease site.Two PCR reaction are then performed, each using a vector primer and a bridge primer. The PCR products are next digested with Dpn I and the corresponding type IIs class endonuclease. The digested products are subsequently ligated with the mutagenic fragment to form the mutant.

在長(zhǎng)的載體序列上，可能在載體序列內(nèi)部，含有相應(yīng)Type IIs類限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。為證明我們提供的方法對(duì)這一類載體的有效性[18,19]，我們選擇了另一個(gè)載體pOCT4-Luc2，該載體和前面的實(shí)驗(yàn)的區(qū)別，僅是在載體序列中含有一個(gè)Esp3I位點(diǎn)，其它部分沒有區(qū)別。我們利用這個(gè)載體，分別以V-primer A、B-primer A1；V-primer B、B-primer B1和V-primer A、B-primer A2；V-primer B、B-primer B2進(jìn)行了以上所描述的實(shí)驗(yàn)，這樣在借助Esp 3I位點(diǎn)進(jìn)行酶切時(shí)，就多出現(xiàn)一個(gè)片段，最后進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)實(shí)際上是四個(gè)DNA片段進(jìn)行連接，得到的突變載體為2-AA1BB1、2-AA2BB2。，實(shí)驗(yàn)最后挑取單克隆，并對(duì)其中所含有的載體序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，突變載體2-AA1BB1測(cè)序的12個(gè)克隆中，其中12個(gè)克隆含有所需要的突變，突變率達(dá)到100%；突變載體2-AA2BB2測(cè)序的11個(gè)克隆中，其中11個(gè)克隆含有所需要的突變，突變率達(dá)到100%。這個(gè)結(jié)果說明，我們所提供的方法，對(duì)內(nèi)部含有Type IIs限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的序列也有很好的突變效率。圖4A顯示了實(shí)驗(yàn)中四個(gè)突變載體的突變效率，圖4B為突變片段的測(cè)序圖。

3 討論

我們描述了一種適合在長(zhǎng)載體序列中引入定點(diǎn)突變的方法。這種方法是在我們最近報(bào)告的依賴于Type IIs類的限制性內(nèi)切酶和人工化學(xué)合成的突變雙鏈的突變方法的基礎(chǔ)上形成的。我們的方法利用了最近所報(bào)告的方法的高效特點(diǎn)[20]，另一方面，又利用在載體序列的合適位置上的橋點(diǎn)，從而將長(zhǎng)的載體序列分成幾個(gè)小于7 kb的短的序列進(jìn)行擴(kuò)增。我們?cè)谝粋€(gè)超過9 kb載體序列上，成功地引入了復(fù)雜突變。另一方面，由于在實(shí)驗(yàn)中使用了Type IIs類的限制性內(nèi)切酶，在長(zhǎng)的載體序列的內(nèi)部，也有可能出現(xiàn)這樣的位點(diǎn)，我們對(duì)這種情況下的突變也進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果也表明，載體序列內(nèi)部的與所選擇的Type IIs類限制性內(nèi)切酶一致的位點(diǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)不構(gòu)成影響。在我們的實(shí)驗(yàn)中，所使用的Type IIs類的限制性內(nèi)酶位點(diǎn)是Esp3I位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)可以滿足大部分的實(shí)驗(yàn)要求，不過，如果實(shí)驗(yàn)需要，也可以選擇其它的類似的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)[21,22]，例如SapI等。我們所提供的方法，實(shí)驗(yàn)操作非常簡(jiǎn)單。從序列的PCR擴(kuò)增到將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入受體菌，一天之內(nèi)就可以完成。在我們的實(shí)驗(yàn)操作中，我們一般會(huì)提前一天進(jìn)行PCR反應(yīng)，那么，第二天的工作就可以輕松完成。相對(duì)與其它類似的方法，我們所提供的方法具有很大的優(yōu)勢(shì)。我們所描述的方法，為在長(zhǎng)載體序列中進(jìn)行突變提供了有效的工具。

圖2 實(shí)驗(yàn)中所使用的堿基序列Fig 2 Oligonucleotides used in the experiments

圖3 實(shí)驗(yàn)步驟。圖中Esp3I酶切位點(diǎn)用黑體字標(biāo)出，被突變的堿基用下劃線標(biāo)示。Fig 3 The experimental procedure. The type IIs restriction enzyme sites, Esp3I,are in bold and the mutational sites are underlined.

圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及測(cè)序圖。A：突變的成功率；B：實(shí)驗(yàn)測(cè)序圖。Fig 4 Sequencing results of the mutants. A: Mutational rate of the mutants; B: Sequencing maps of the mutants.