徐 凱，徐國(guó)昌 ，張 玥，任 甫

·法醫(yī)學(xué)·

改良酚/氯仿法結(jié)合miniSTR分型技術(shù)檢驗(yàn)陳舊骨痕量DNA

徐 凱1，徐國(guó)昌2，張 玥3，任 甫4

目的建立5個(gè)miniSTR基因座的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，提高STR基因座對(duì)陳舊骨檢材的個(gè)體識(shí)別效能。方法新設(shè)5個(gè)STR基因座的引物，分別用FAM、TAMRA、TET標(biāo)記D3S3053、D18S853、D12ATA63、D6S474、D9S1122，通過(guò)PCR擴(kuò)增，利用ABI3100xL遺傳分析儀進(jìn)行片段長(zhǎng)度分析，對(duì)84份河南漢族無(wú)關(guān)個(gè)體血樣，以及25例陳舊骨檢材進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果5個(gè)基因座均得到有效擴(kuò)增，在河南漢族人群中5個(gè)miniSTR基因座個(gè)體識(shí)別能力DP為0.8768～0.9623，雜合度H為0.7454～0.8934，多態(tài)信息含量PIC為0.7145～0.8214。5個(gè)miniSTR基因座總DP值為0.999 996 72。用Identifil試劑盒及miniSTR技術(shù)對(duì)25份陳舊骨檢材的位點(diǎn)檢出率分別為60.25%和84.80%。結(jié)論上述5個(gè)miniSTR基因座在河南漢族人群中等位基因分布較好，個(gè)體識(shí)別能力高，適用于個(gè)人識(shí)別和親權(quán)鑒定，同時(shí)為陳舊骨痕量DNA樣本分型提供了一種新的檢測(cè)方法。

miniSTR；遺傳多態(tài)性；陳舊骨

由于PCR擴(kuò)增高度多態(tài)性的STR基因座是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域目前用于親子鑒定和個(gè)人識(shí)別的主流技術(shù)，在時(shí)間較久的埋尸、溺水等案件和考古人類(lèi)學(xué)中，機(jī)體的軟組織大部分被毀和降解，無(wú)法應(yīng)用常規(guī)檢材進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。因此，不斷尋找新的STR基因座仍然非常重要。骨骼作為一類(lèi)特殊的檢材，相對(duì)于人體的其他組織抗腐敗能力強(qiáng)且保存時(shí)間長(zhǎng)[1]，故其在上述系列案件和研究中對(duì)于個(gè)體識(shí)別起到越來(lái)越重要的作用。陳舊骨DNA的檢出率受時(shí)間、環(huán)境等因素的影響，時(shí)間越久遠(yuǎn)、環(huán)境越極端，DNA檢出成功率越低，甚至失去了檢材的應(yīng)用價(jià)值。MiniSTR技術(shù)設(shè)計(jì)的引物更靠近核心重復(fù)序列，因此產(chǎn)生的STR等位基因片斷長(zhǎng)度更短，分型成功率獲得很大提高[2]。MiniSTR 技術(shù)被證明是一種有效的從微量以及降解檢材中獲得遺傳信息的方法，在提高降解檢材分型成功率方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[3-4]。本研究根據(jù)Hill[5]等最新研究進(jìn)展選擇D3S3053等5個(gè)新的miniSTR位點(diǎn)研究其多態(tài)性，且成功應(yīng)用于陳舊骨檢材的個(gè)體識(shí)別，為陳舊骨等降解檢材的個(gè)體識(shí)別提供了一種新的方法。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象84例河南地區(qū)無(wú)關(guān)個(gè)體血樣，日常受理案件中經(jīng)Identifiler試劑盒分型不理想的陳舊骨(3～10 a室溫保存)檢材25份。

1.2 DNA提取無(wú)關(guān)血樣采用Chelex法提取DNA。陳舊骨檢材采用改良酚/氯仿法提取DNA。陳舊骨樣本DNA提取主要步驟為：①生物冷凍研磨機(jī)研磨，液氮環(huán)境，設(shè)置預(yù)冷15 min，研磨2次，每次10 min；②pH=8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)骨粉脫鈣，適時(shí)更換脫鈣液，每次更換時(shí)均要離心，50℃水?。虎埏柡头优湟匀燃淄椋寒愇齑?24∶1)混液，兩者體積比為4.5∶1，之后用三氯甲烷∶異戊醇混液離心；④正丁醇600 μL，混勻，離心后棄上液。乙醚600 μL，混勻，離心后棄上液，置于50℃，數(shù)分鐘，揮發(fā)完全；⑤Buffer PB5 mL，RNA1 μL，冷凍離心后取上液，通過(guò)硅膜管，每次約700 μL，離心后棄下液。PB700 μL再洗1次；PE洗液700 μL，混勻，離心，重復(fù)3次，離心8 000 r/min，8 min；52℃10 min EB30 μl，加入管底中央?yún)^(qū)，52℃ 5 min，冷凍離心13 000 r/min，8 min。

1.3 PCR擴(kuò)增5個(gè)miniSTR基因座的引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增體系在GeneAmp-9700中進(jìn)行，DNA濃度1 ng/μL，1 GeneAmp-PCR Gold buffer，2 μM MgCl2，0.2 μM引物，1U AmpliTaq Gold DNA 聚合酶，0.16 mg/mL牛血清蛋白?？偡磻?yīng)體積為10 μM，PCR 擴(kuò)增條件為：預(yù)變性10 min 95℃，變性1 min 94℃，復(fù)性1 min 59℃，延伸1 min 72℃，復(fù)延伸45 min 60℃，最后保存在25℃。共28個(gè)循環(huán)。

表1 5個(gè)miniSTR基因座及引物序列

1.4 等位基因階梯的制備篩選出所有等位基因片段的DNA，調(diào)整各DNA終濃度達(dá)到一致。取等體積混合，擴(kuò)增混合物，其產(chǎn)物作為allelic ladder。把所測(cè)每個(gè)樣本模板等體積混合，每個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如上所述。擴(kuò)增完之后取每個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL加1 mL水稀釋混合，在上述條件下再次擴(kuò)增，經(jīng)15次循環(huán)，在60℃下保存4 h。

1.5 電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物1.2 μL，Hi-Di 9 μL，GS500LIZ 0.4 μL，混勻變性，于ABI PRISMI3130xL型遺傳分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。Gene mapper 3.2軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 5個(gè)miniSTR基因座均得到有效擴(kuò)增等位基因分布頻率見(jiàn)表2。期望雜合度(H)、多態(tài)信息含量(PIC)、個(gè)體識(shí)別能力(DP)遺傳學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表2 河南漢族人群5個(gè)miniSTR基因座等位基因頻率分布

A：等位基因；F：基因頻率。

表3 河南漢族人群5個(gè)miniSTR基因座的H、PIC、DP值

Loci：STR基因位點(diǎn)；H：親合度；PIC：多態(tài)信息含量；DP：個(gè)體識(shí)別能力。

2.2 陳舊骨檢材的檢測(cè)情況25例陳舊骨檢材用Identifiler(16位點(diǎn))試劑盒檢測(cè)時(shí)，有1例幾乎沒(méi)有獲得目的片段，檢出率50%(含)以下的有9例，總位點(diǎn)檢出率為241/400=60.25%。經(jīng)5個(gè)miniSTR基因座檢測(cè)，有15例擴(kuò)增完全顯示，其中1例無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，總位點(diǎn)檢出率為106/125=84.80%。25例檢材的檢測(cè)情況及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Identifiler試劑盒(A)和5個(gè)miniSTR基因座(B)檢測(cè)結(jié)果比較 例(%)

3 討論

STR是一類(lèi)廣泛存在于真核生物基因組中的DNA重復(fù)序列。STR以核心重復(fù)單位數(shù)目的變化構(gòu)成遺傳多態(tài)性，已廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷和法醫(yī)學(xué)的鑒定。針對(duì)CODIS系統(tǒng)所設(shè)計(jì)的miniSTR 基因座已有報(bào)道，但并非所有CODIS 基因座均適合重新設(shè)計(jì)miniSTR 引物，且有些基因座在中國(guó)人群的多態(tài)性較低，僅用現(xiàn)有試劑盒檢驗(yàn)難以滿(mǎn)足特殊案件個(gè)體識(shí)別及親權(quán)鑒定的需要[6]。馬威[7]等人用D10S1248、D14S1434 和D22S1045 3個(gè)miniSTR 基因座對(duì)東北漢族群體的141 名隨機(jī)個(gè)體樣本進(jìn)行遺傳多態(tài)性研究，認(rèn)為3 個(gè)基因座在東北漢族均具有高度的遺傳多態(tài)性，在群體遺傳學(xué)和法醫(yī)學(xué)研究中有一定的應(yīng)用價(jià)值。

在本研究選擇的5個(gè)位點(diǎn)經(jīng)Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn)，均為P>0.05，說(shuō)明5個(gè)位點(diǎn)都符合Hard-Weinberg平衡。5個(gè)基因座的聯(lián)合DP值為0.999 996 72，均屬于多態(tài)性較好的遺傳標(biāo)記。個(gè)人識(shí)別能力為0.8768～0.9623，提示為能夠適合法醫(yī)應(yīng)用的遺傳標(biāo)記。與目前廣泛使用的常規(guī)商品化試劑盒相比，5個(gè)miniSTR能達(dá)到相同的個(gè)體識(shí)別力。在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中，STR技術(shù)雖已廣泛用于個(gè)人識(shí)別和親權(quán)鑒定方面，但是對(duì)于法醫(yī)學(xué)中一些微量以及降解的檢材，STR技術(shù)并不能成功地得出結(jié)論，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)“優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增”或者“無(wú)效擴(kuò)增”。miniSTR技術(shù)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，使其結(jié)合在更靠近核心重復(fù)序列的側(cè)翼序列，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物就會(huì)比STR基因座更短一些[8-9]。MiniSTR的引物位置決定PCR產(chǎn)物的大小，但與原來(lái)STR基因座相比，核心序列的重復(fù)次數(shù)卻沒(méi)有改變。STR基因座擴(kuò)增成功率與等位基因長(zhǎng)度成反比，當(dāng)樣本DNA降解到100 bp左右時(shí)，用常規(guī)試劑盒檢測(cè)擴(kuò)增效果常常不盡理想。

不同情況的陳舊骨骼存留的STR 基因座檢出結(jié)果會(huì)有所不同，個(gè)體識(shí)別能力也不同。分析原因，主要是由于STR 基因座片斷長(zhǎng)度的差別，使不同的基因座抗降解的能力有所差異，從而使不同基因座在同一檢測(cè)條件下檢出率呈現(xiàn)差異。本研究選用擴(kuò)增片段很短的miniSTR基因座(70～140) bp對(duì)Identifiler試劑盒擴(kuò)增不成功的25例陳舊骨檢材再次進(jìn)行miniSTR基因分型，結(jié)果大部分得到了清晰的等位基因條帶，顯示miniSTR技術(shù)檢測(cè)小片段DNA的成功率比一般商品化試劑盒高，有助于法醫(yī)學(xué)上降解檢材的檢測(cè)。

總之，陳舊骨的個(gè)體識(shí)別目前尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，陳舊骨基因水平的檢測(cè)需要更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)指標(biāo)。MiniSTR作為STR檢驗(yàn)的一個(gè)新的發(fā)展方向，是商品化STR試劑盒的重要補(bǔ)充，可以更好地解決法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中遇到的降解檢材痕量DNA分型的難題，能更好地為法庭科學(xué)服務(wù)。

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AnalysisonTraceDNAfromObsoleteBonesbyPhenol-chloroformCoupledwithMiniSTRTechnicalMethod

XU Kai，XU Guo-chang,ZHANG Yue,et al

(Henan Province People’s Procuratorate,Zhengzhou 453000,China)

ObjectiveTo establish five loci multiplex amplification miniSTR systems,and to improve forensic detection performance of the obsolete bone samples with the STR loci.MethodsThe new five STR loci(D3S3053,D18S853,D12ATA63,D6S474,D9S1122) primers were designed and marked by FAM,TAMRA,TET,amplified by PCR and analysized using the ABI3100xL genetic analyzer for fragment length analysis.84 Henan Han Nationality blood samples of unrelated individuals,and 25 cases of obsolete bone samples were collected for testing.Results5 loci were effectively amplified,the 5 miniSTR recognition rate(DP) of individual loci in the Han Nationality population was 0.8768～0.9623,the heterozygosity (H) was 0.7454～0.8934,and the polymorphism information content (PIC) is 0.7145～0.8214.The total 5 miniSTR loci DP was 0.999 996 72.The detection rate of remaining genetic locus of the 25 obsolete bones was 84.80% by Identifiler kit,and 60.25% by miniSTR method.ConclusionThe five miniSTR loci in Han Nationality population in Henan Province is better distributed and easily recognized as a individual identification and paternity testing,and provides a new detection method for DNA samples typing of obsolete bones.

miniSTR; genetic polymorphisms; obsolete bones

河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目(132300410088) 遼寧省百千萬(wàn)人才工程培養(yǎng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(2010921042)

2013-11-20

1.河南省人民檢察院，河南鄭州 453000 2.南陽(yáng)理工學(xué)院生物人類(lèi)學(xué)研究所，河南南陽(yáng) 473004 3.重慶市公安局，重慶 400000 4.遼寧醫(yī)學(xué)院人類(lèi)學(xué)研究所，遼寧錦州 121000

徐凱(1974-)，男，河南駐馬店人，法醫(yī)師，從事法醫(yī)病理學(xué)研究。

徐國(guó)昌，碩士，副教授，E-mail:xuguoch@163.com

Q987

A

1672-688X(2014)01-0057-04