劉釗 李易明 王冀 王蕾 李文建

·論著·

缺氧缺血性腦病新生大鼠腎臟Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)與腎細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

劉釗 李易明 王冀 王蕾 李文建

目的探討缺氧缺血性腦病(HIE)新生大鼠腎臟Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)與腎細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法新生7 d Wistar大鼠制備HIE模型。分為假手術(shù)對(duì)照組和HIE組，于HIE后6、12、24和48 h處死大鼠，取腎臟組織，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡情況；應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況；ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β的分泌；應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡與p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)系。結(jié)果HIE組6 h腎臟陽(yáng)性凋亡細(xì)胞開(kāi)始增多，24 h達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性凋亡細(xì)胞均高于對(duì)照組(P<0.05)； HIE組12 h Bax和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)開(kāi)始增多，24 h達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞均高于對(duì)照組(P<0.05)；HIE組6 h TNF-α、IL-1β分泌開(kāi)始增多，TNF-α12 h達(dá)到高峰，IL-1β 24 h達(dá)到高峰各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β均高于對(duì)照組(P<0.05)；HIE組6 hp-p38MAPK蛋白表達(dá)開(kāi)始增多并達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)p-p38MAPK蛋白均高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論HIE新生大鼠腎臟細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)增加，提示Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)對(duì)腎臟細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，其可能通過(guò)p-p38MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

Bax；Caspase-3；凋亡；缺氧缺血性腦??；腎臟細(xì)胞；p-p38MAPK

缺氧缺血性腦病是圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致腦組織缺氧缺血性損傷，是新生兒常見(jiàn)疾病，是新生兒死亡或運(yùn)動(dòng)、智力障礙的常見(jiàn)原因[1]。HIE除腦組織缺氧缺血性損傷外，全身多器官均有損傷，其中，腎臟為損傷的重要臟器之一。目前，人們對(duì)HIE造成的腦損傷研究報(bào)道較多[2，3],而對(duì)HIE發(fā)生后腎臟損傷研究較少，凋亡相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)腎細(xì)胞凋亡的影響鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡情況；應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況；ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β的分泌；應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡與P38MAPK信號(hào)通路的關(guān)系，探討HIE新生兒腎臟損傷的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國(guó)BD公司)；鼠抗兔Bax和Caspase-3單抗、TNF-α、IL-1 βELISA試劑盒(美國(guó) eBioscience公司)；蛋白酶抑制劑、去磷酸化酶抑制劑、p-P38和β-actin抗體(美國(guó)Sigma公司)；Western blot試劑和標(biāo)準(zhǔn)Marker(美國(guó)Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Invitrogen公司)；蛋白電泳(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 將生長(zhǎng)條件相同的新生7 d Wistar大鼠，雌雄不限，共40只，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組和HIE(6、12、24和48 h)組，每組8只。假手術(shù)對(duì)照組只予分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎動(dòng)脈，縫合皮膚；HIE組分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合皮膚，術(shù)后放回鼠籠恢復(fù)2 h。隨后，置于密閉玻璃器皿中，以濕化的8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w輸入玻璃器皿中，持續(xù)3～4 h制成新生大鼠HIE動(dòng)物模型[4]。

1.3 標(biāo)本取材 HIE后6、12、24和48 h后處死大鼠，去除腎臟包膜，沿矢狀正中線(xiàn)切開(kāi)，將腎臟皮質(zhì)分為4份，分別用于流式檢測(cè)、免疫組織化學(xué)、ELISA和Western blot檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Annexin V凋亡檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡情況：收集腎細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×106cells/ml，按照BD試劑盒說(shuō)明書(shū)完成Annexin V-FITC/PI雙染色后，PBS洗滌后，立刻上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2 免疫組化檢測(cè)Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)：腎臟石蠟包埋組織切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加一抗(Bax和Caspase-3單抗)，室溫孵育1 h，加試劑A-聚合物增強(qiáng)劑，室溫孵育20 min，加試劑B-酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫孵育30 min，再經(jīng)DAB顯色，蘇木素襯染，脫水干燥，中性樹(shù)脂封片。

1.4.3 TNF-α、IL-1β細(xì)胞因子的檢測(cè)：將腎皮質(zhì)用剪刀剪碎再用玻璃勻漿器充分勻漿，12 000 r/min，4℃，離心30 min后取上清，TNF-α、IL-1β濃度的檢測(cè)采用ELISA法，具體操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.4 Western blot檢測(cè)P38MAPK信號(hào)通路情況：將腎臟用剪刀剪碎，按照蛋白抽提試劑盒說(shuō)明加入試劑，再用玻璃勻漿器充分勻漿。12 000 r/min，4℃，離心30 min后取上清，取上清液后進(jìn)行蛋白定量。制備的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離，再以400 mA恒流電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,再加入一抗4℃孵育過(guò)夜，次日TBS-T洗滌3次，10 min/次，加入辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再TBS-T洗滌3次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠腎細(xì)胞凋亡的情況 結(jié)果顯示對(duì)照組陽(yáng)性凋亡細(xì)胞為2.75%，HIE組6 h腎臟陽(yáng)性凋亡細(xì)胞開(kāi)始增多，24 h達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性凋亡細(xì)胞仍高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 腎細(xì)胞凋亡活性的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

2.2 5組大鼠腎臟組織Bax和Caspase-3免疫組化染色結(jié)果比較 應(yīng)用免疫組化染色顯示，HIE組Bax和Caspase-3表達(dá)量明顯升高，可見(jiàn)大量的強(qiáng)陽(yáng)性棕褐色顆粒，而對(duì)照組中Bax和Caspase-3的表達(dá)極低，幾乎看不到棕褐色顆粒，差異明顯(P<0.05)；在HIE后24 h Bax和Caspase-3表達(dá)達(dá)到高峰，明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 5組大鼠腎組織Bax蛋白表達(dá)圖像(免疫組化×400)

圖3 5組大鼠腎組織Caspase蛋白表達(dá)圖像(免疫組化×400)

2.3 ELISA測(cè)定TNF-α、IL-1β分泌水平變化 采用ELISA技術(shù)檢測(cè)5組腎細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β的分泌。HIE組6 h TNF-α、IL-1β分泌開(kāi)始增多，TNF-α 12 h達(dá)到高峰，IL-1β 24 h達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β的分泌均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 ELISA檢測(cè)腎組織中細(xì)胞因子分泌情況

組別對(duì)照組HIE6hHIE12hHIE24hHIE48hTNF-α20.0±2.822.8±2.9*29.8±3.2*35.2±3.9*23.9±4.0*IL-1β1.7±0.92.1±0.9*2.8±0.6*3.2±0.8*2.2±0.5*

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 Western blot測(cè)定p-p38MAPK信號(hào)通路的變化 HIE組p-p38MAPK蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)，其中HIE組中，6 hp-p38MAPK表達(dá)明顯高于其他時(shí)間段，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 不同組大鼠腎組織的p-p38MAPK表達(dá)

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于HIE神經(jīng)細(xì)胞凋亡的報(bào)道較多[5，6]，但腦組織損傷后造成其他器官功能改變的機(jī)制尚不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)采用新生7 d Wistar大鼠HIE模型，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HIE大鼠腎細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果表明，假手術(shù)對(duì)照組偶見(jiàn)陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，HIE組，6 h陽(yáng)性凋亡細(xì)胞開(kāi)始增加，24 h到達(dá)頂峰，且明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，證明HIE過(guò)程中，腎細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)細(xì)胞程序化死亡，是由多基因控制的細(xì)胞生理性、自主性的死亡過(guò)程[7]。細(xì)胞發(fā)生凋亡主要有兩種途徑：死亡受體/Fas途徑和線(xiàn)粒體途徑，其中Caspase-8介導(dǎo)死亡受體/Fas途徑，Caspase-9介導(dǎo)線(xiàn)粒體途徑，兩途徑都是由Caspase的活化而啟動(dòng)的[8]。Caspase-8和Caspase-9下游分子均為Caspase-3，其是Caspase家族中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，是發(fā)生凋亡的標(biāo)志酶[9]。Caspase-9介導(dǎo)線(xiàn)粒體途徑，主要受Bcl-2家族蛋白調(diào)控，Bax屬于Bcl-2家族，為凋亡誘導(dǎo)蛋白。當(dāng)Bax二聚體形式存在時(shí)，其在線(xiàn)粒體外膜形成離子通道從而改變線(xiàn)粒體的通透性，細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10，11]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定HIE 狀態(tài)下腎組織bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，假手術(shù)對(duì)照組腎臟組織中bax和Caspase-3蛋白呈弱陽(yáng)性，HIE組12 h開(kāi)始出現(xiàn)較多的陽(yáng)性細(xì)胞，24 h達(dá)到高峰，后緩慢降低，但仍高于對(duì)照組。將bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)與流式細(xì)胞儀測(cè)得凋亡細(xì)胞數(shù)做相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)增加，凋亡細(xì)胞數(shù)也增加，提示在HIE模型中，通過(guò)激活Bax/Caspase-3通路誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞的線(xiàn)粒體依賴(lài)性凋亡。

研究表明，在HIE模型中腦組織缺氧缺血后引發(fā)多種免疫細(xì)胞和免疫分子參與的炎性反應(yīng)，造成免疫功能紛亂。Wixey等[12，13]研究證實(shí)，缺氧缺血后的新生鼠腦組織中 IL-1β和TNF-α水平增加。本實(shí)驗(yàn)利用ELISA首先來(lái)檢測(cè)炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，結(jié)果顯示HIE組TNF-α和IL-1β的分泌均明顯高于對(duì)照組，其中在HIE組中，24 hTNF-α和IL-1β的含量要高于其他組。同時(shí)WB檢測(cè)p-p38MAPK蛋白的表達(dá)，HIE組中，6 h p-p38MAPK蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組。腎組織在缺氧缺血的狀態(tài)下，IL-1β和TNF-α等炎性因子水平增加，其做為上游因子可激活MAPK家族成員[14]，如p38MAPK，其通過(guò)下游的因子激活Bax和Caspase-3蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡過(guò)程，以上結(jié)果提示p38MAPK磷酸化可能有促凋亡作用。

綜上所述，研究證實(shí)在HIE新生大鼠腎細(xì)胞缺氧缺血的狀態(tài)下，能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌增加，從而激活p-p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)，引起腎臟細(xì)胞凋亡，而且通過(guò)實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的時(shí)間組來(lái)看，12～24 h的Bax和Caspase-3蛋白高表達(dá)，闡明對(duì)于HIE的患者，早期診斷，早期治療有著重要意義。

1 Yang D,Nemkul N,Shereen A,et al.Therapeutic administration of plasminogen activator inhibitor-1 prevents hypoxic-ischemic brain injury in newborn.J Neurosci,2009,29:8669-8674.

2 Gunn AJ，Thoresen M.Hypothrmic neuroprotection.Neuro Rx，2006,3:154-169.

3 Perlman M,Shah PS.Hypoxic-ischemic encephalopathy:challenges in outcome and prediction.J Pediatr,2011,158:51-54.

4 Vannucci RC,Vannucci SJ.Perintal hypoxic-ischemic brain damage:Evolution of an animal model.Dev-Neurosci,2005,27:81-86.

5 Lemaire C,Godefroy N,Gostina-Parvu I,et al.Caspase-9 can antagonize p53-induced apoptosis by generating a p76(Rb) truncated form of Rb.Oncogene,2005,24:3297-3308.

6 Kiechle FU,zhang X.Apoptosis:biochemical aspects and clinical implications.Clin Chim Acta,2002,326:27-45.

7 Hallett JM,Leitch AE,Rilry NA,et al.Novel pharmacological strategies for driving inflammatory cell apoptosis and enhancing the resolution of inflammation.Trends Pharmacol Sci,2008,29:250-257.

8 Yamaura K，Watanabe T,Boenisch O，et al.In vivo function of immune inhibitory molecule B7-H4 in alloimmune responses.Am J Transplant,2010,10:5767-5777.

9 Higuchi M,Aggarwal BB,Yeh ET.Activation of CPP32-like protease in tumor necrosis factor-induced apoptosis is dependent on mitochondrial function.J Clin Invest,1997,99:1751-1758.

10 Thomadaki H,Scorilas A.BCL-2 family of apoptosis-related genes:functions and clinical implications in cancer.Crit Rev Clin Lab Sci,2006,43:61-67.

11 Herr I,Debatin K.Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy.Blood,2001,98:2603-2604.

12 Wixey JA,Reinebrant HE,Spencer SJ,et al.Efficacy of post-insult minocycline administration to alter long-term hypoxia-ischemia-induced damage to the serotonergic system in the immature rat brain.Neuroscience,2011;19:184-192.

13 張耕，侯亞利，趙自剛，等.腸淋巴途徑在二次打擊致大鼠腎功能衰竭中的作用.中國(guó)微循環(huán),2007,11:353-355.

14 Wang XJ，Kong KM，Qi WL，et al．Interleukin-1 beta induction of neuron apoptosis depends on p38 miftogen-activated protein kinase activity after spinal cord injury.Acta Pharmacol Sin，2005，26:934-942.

ExpressionofBaxandCaspase-3proteininkidneyofneonatalratswithhypoxic-ischemicencephalopathyaswellastheactionmechanismofapoptosisinrenalcells

LIUZhao*,LIYiming*,WANGJi,etal.*ClinicalCollegeofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo investigate the expression of Bax and Caspase-3 in kidney of neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE) as well as the action mechanism of apoptosis in renal cells.MethodsHIE models were established in seven-day-old Wistar rats,then these rats were randomly divided into sham operation control group and HIE group.The rats were executed at 6h,12h,24h,48h after HIE and kidney tissues were obtained.The apoptosis condition of renal cells was detected by flow cytometry,and expression of Bax and Caspase-3 protein was determined by immunohistochemistry,the levels of TNF-αand IL-1β were detected by ELISA,and renal cells apoptosis and P38MAPK signaling pathway were examined by Western Blot.ResultsIn HIE group,positive apoptosis cells were increased at 6h and reached peak at 24h,which were significantly higher than those in control group in different time points(P<0.05).More Bax and Caspase-3 positive cells appeared at 12h in HIE group and peaked at 24h,and positive cells in different time points were significantly higher than those in control group(P<0.05).At 6h,the levels of TNF-αand IL-1βwere increased in HIE group,and TNF-αreached peak at 12h,however,IL-1βreached peak at 24h,and the levels of TNF-α and IL-1β in different time points were significantly higher than those in control group(P<0.05).The expression levels of p-P38MAPK protein were increased at 6h in HIE group and reached the peak,and the expression levels of p-P38MAPK protein were significantly higher than those in control group in different time points(P<0.05).ConclusionThe expression levels of Bax and Caspase-3 in renal cells of neonate rats with HIE are increased,which suggests that the expression of Bax and Caspase-3 contributes to the apoptosis of renal cells via p-P38MAPK signaling pathway.

Bax；Caspase-3；apoptosis；hypoxic-ischemic encephalopathy；renal cell；p-p38MAPK

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.001

050031 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院(劉釗、李易明)，教務(wù)處(王冀)，免疫教研室(李文建)；河北省保定市第一中心醫(yī)院分院(王蕾)

李文建，050017 河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室；

E-mail：liwenjian969@sohu.com

R 742.8

A

1002-7386(2014)11-1605-04

2013-12-11)