★ 王一涵 于洋 許文迪 董雪蓮

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林 長(zhǎng)春 130117)

該復(fù)方制劑為臨床經(jīng)驗(yàn)方，是由紅參、附子、甘草等組成的復(fù)方中藥制劑，具有益氣養(yǎng)血、通陽(yáng)復(fù)脈之功效，主要用于治療陽(yáng)氣血弱之心悸病[1]。該制劑現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只以甘草中甘草苷為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，控制其質(zhì)量。但其組方中附子即為君藥又為毒性藥物，有必要對(duì)其毒性成份進(jìn)行限定，以確保其用藥安全。本文旨在建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方制劑中烏頭類(lèi)生物堿成份的含量測(cè)定方法，完善其質(zhì)量控制指標(biāo)，為臨床安全用藥奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀，EL204電子天平(萬(wàn)分之一)，XS205電子天平(十萬(wàn)分之一)，GKC-11-CR2電子恒溫水浴鍋(500W)。

1.2 試藥 本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所：苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品(111795-200901)；苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品(111794-200901)；苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品(111796-200901)；烏頭堿對(duì)照品(110720-201111)；新烏頭堿對(duì)照品(110799-200505)；次烏頭堿對(duì)照品(110798-200404)；甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純；乙醚、甲醇、鹽酸等為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Tc-C18(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相A：乙腈-四氫呋喃(25∶15)；流動(dòng)相B：0.1mol/L乙酸銨溶液(每1 000mL加0.7mL冰醋酸)[2-5]。洗脫程序：0～48min,15%→26%A；48～49min，26%→35%A；49～58min，35%A；58～65min，35%→15%A；65～95min，15%A。柱溫25℃，流速0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。

2.2 混合對(duì)照品溶液配制 精密稱(chēng)取苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品、烏頭堿對(duì)照品、新烏頭堿對(duì)照品、次烏頭堿對(duì)照品4.98，4.96，3.99，4.92，5.08，4.96mg，加0.05%鹽酸-甲醇溶液(V/V)定容于50mL容量瓶?jī)?nèi)，分別配制成質(zhì)量濃度為0.0993，0.0978，0.0794，0.0972，0.1016，0.0992mg/mL的對(duì)照品母液。分別精密移取上述母液各1mL置于容量瓶?jī)?nèi)混合均勻，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末，過(guò)60目篩，精密稱(chēng)取3g，置150mL錐形瓶?jī)?nèi)，加4.5mL氨試液潤(rùn)濕30min。精密加入100mL乙醚，稱(chēng)定重量，水浴40℃加熱回流15min，立即冷卻，加乙醚補(bǔ)足失重，密封放置12h，過(guò)濾，殘?jiān)右颐严礈靸纱?，每?0mL，合并乙醚液置于蒸發(fā)皿內(nèi)50℃低溫蒸干，殘?jiān)?.05%鹽酸-甲醇溶液(V/V)溶解，定容至5mL容量瓶?jī)?nèi)，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液2，5，8，10，15，20，25μL，注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得六混標(biāo)線性回歸方程如下表1。

表1 回歸方程和線性范圍

2.4.2 精密度考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)6次，記錄峰面積，計(jì)算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的RSD值分別為：2.8053%，1.7093%，2.7583%，2.3620%，1.6608%，2.6190%，結(jié)果表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一混標(biāo)溶液分別于0，3，6，12，24，36h按上述液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得峰面積計(jì)算RSD值分別為：2.33%，2.35%，2.66%，1.15%，2.12%，1.44%，結(jié)果表明在36h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同一供試品溶液同上方法測(cè)定，計(jì)算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、次烏頭堿RSD值分別為：1.61%，1.25%，1.98%，3.02%，表明穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重現(xiàn)性考察 取樣品粉末6份，按2.3項(xiàng)下供試品方法處理，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算含量。苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、次烏頭堿平均含量分別為：2.1366，0.3903，0.7561，0.0358mg/g，RSD值分別為1.04%，1.59%，0.90%，2.49%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.4.5 加樣回收率考察 取已知含量樣品粉末6份，精密稱(chēng)定約0.25g，分別精密加入一定量的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、次烏頭堿，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、次烏頭堿平均加樣回收率分別為：102.14%(RSD2.90%)，100.86%(RSD2.73%)，101.49%(RSD1.02%)，101.71%(RSD2.39%)。

2.4.6 樣品含量測(cè)定 取三批不同樣品，按供試品溶液方法制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果該顆粒中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、次烏頭堿含量見(jiàn)表2。

表2 三批復(fù)方制劑中烏頭類(lèi)生物堿含量 /μg·g-1

3 討論

目前對(duì)于附子生物堿類(lèi)成份含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道并不少見(jiàn)。孫蘭[6]等采用乙腈-堿性乙酸銨緩沖溶液為流動(dòng)相達(dá)到了分離效果，但分離時(shí)間在65min以上較長(zhǎng)，同時(shí)堿性(pH=10)流動(dòng)相不適用于普通色譜柱。陳東安[7]等雖然大大縮短了分離時(shí)間，但其分離效果并不十分理想，同時(shí)其采用C18固相萃取小柱進(jìn)行供試品處理過(guò)于繁瑣。本實(shí)驗(yàn)所建立的烏頭類(lèi)生物堿的含量測(cè)定方法具有良好的線性關(guān)系，科學(xué)穩(wěn)定，高效靈敏，對(duì)附子相關(guān)制劑質(zhì)量控制具有一定意義。

本文在藥典方法的基礎(chǔ)上，對(duì)流速、流動(dòng)相等色譜條件稍加改動(dòng)，達(dá)到了良好的分離效果。對(duì)于提取方法的優(yōu)化本文做了大量實(shí)驗(yàn)對(duì)比，最終確定乙醚為提取溶劑。采用低溫水浴加熱回流法，較之前的浸泡法大大提高了效率，同時(shí)避免了超聲法隨時(shí)間水溫增加不易控制的弊病，節(jié)約了時(shí)間，增加了提取效率。采用0.05%鹽酸甲醇為溶劑，減少了對(duì)色譜峰的干擾，分離度較好。本實(shí)驗(yàn)所采用的梯度洗脫程序科學(xué)合理，使色譜峰之間都能達(dá)到良好分離，同時(shí)分離時(shí)間適中，50min內(nèi)即可完成分離，且避免了梯度洗脫普遍易出現(xiàn)的基線漂移現(xiàn)象。

附子由于經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間水煎煮等工藝環(huán)節(jié)后，強(qiáng)毒性的新烏頭堿、烏頭堿受熱水解成單酯型烏頭堿而檢測(cè)不出。強(qiáng)毒性的次烏頭堿大部分也都水解了，成品中次烏頭堿含量?jī)H僅為1.6μg/g。強(qiáng)毒性生物堿的總含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定50多倍，表明該復(fù)方制劑臨床應(yīng)用安全可靠。測(cè)得復(fù)方制劑中三種單酯型生物堿總含量均高于藥典規(guī)定最低限值，表明該復(fù)方制劑療效可靠，其含量平均值為52.74μg/g，下浮20%，最終確定復(fù)方顆粒三種無(wú)毒單酯型生物堿含量下限為不少于40μg/g。本文對(duì)復(fù)方制劑中附子成份做了含量限定，對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行補(bǔ)充，為今后該復(fù)方制劑控制奠定了基礎(chǔ)。

[1]孫佳欣.強(qiáng)心復(fù)脈顆粒制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].長(zhǎng)春:長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),2012:8-46.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典.一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:177.

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