★ 李福龍 羅娟敏 張文惠 肖雪

(1.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心 江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330096；3.中山大學(xué)南沙研究院 廣東 廣州 511458)

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，其味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)，有開宣肺氣，祛痰排膿之功效。臨床上用于治療咳嗽痰多，胸悶不暢，咽痛，音啞，肺癰吐痰，瘡瘍膿成不潰等癥。主要化學(xué)成分為齊墩果酸型五環(huán)三萜皂苷，桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D等，其他尚含有黃酮、聚炔、甾體、酚酸、脂肪酸等類型的化合物。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法建立了桔梗藥材的指紋圖譜。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法具良好穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，符合指紋圖譜測(cè)定要求；運(yùn)用國(guó)家藥典委員會(huì)研發(fā)的相似度計(jì)算軟件，對(duì)13批桔梗藥材指紋圖譜進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果相似度良好，該法可用于桔梗藥材的質(zhì)量控制研究。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，Chemstation色譜工作站，Dionex C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)。

1.2 試藥 乙腈(TEDIA公司，色譜純)，甲酸(TEDIA公司，色譜純)，Milli Q超純水(自制)；桔梗標(biāo)準(zhǔn)藥材(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：121028-201210)，桔梗藥材分別購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)及南昌匯仁堂藥店，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)汪國(guó)華教授鑒定均為Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，按中國(guó)藥典2010年版一部第259頁(yè)桔梗項(xiàng)下方法檢測(cè)均為合格產(chǎn)品。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Dionex C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)二元系統(tǒng)梯度洗脫；梯度洗脫程序見表1；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫運(yùn)行70min，記錄0～70min的色譜圖。

2.2 供試品溶液的制備 取干燥桔梗，粉碎，過三號(hào)篩，于60℃恒溫干燥箱中干燥3h，冷至室溫，精密稱取1g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇30mL，超聲30min，濾過，收集濾液，濾渣中再精密加入50%甲醇30mL，超聲30min，濾過，合并濾液，置水浴中蒸干，用甲醇定容至50mL量瓶中，取續(xù)濾液，過0.22μm微孔濾膜，備用。

表1 梯度洗脫表

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，考察各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.35%，相對(duì)峰面積的RSD值為2.18%～4.85%。表明本實(shí)驗(yàn)儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0，1，2，4，8，12，24h進(jìn)色譜分析，記錄色譜圖，考察各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.64%，相對(duì)峰面積的RSD為1.27%～4.76%，說明樣品在常溫實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性較好，在24h內(nèi)能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定可靠。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品，重復(fù)制備6份供試品溶液，考察色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值的一致性。結(jié)果各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.37%，相對(duì)峰面積的RSD值為1.21%～4.38%，結(jié)果說明此方法結(jié)果可重復(fù)性良好。

2.4 測(cè)定方法 分別精密量取各批次供試品溶液10μL，注入液相色譜，記錄色譜圖，見圖1。

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 利用上述指紋圖譜測(cè)定方法，對(duì)13個(gè)桔梗藥材進(jìn)行指紋圖譜檢測(cè)。標(biāo)定了15個(gè)共有峰，將13個(gè)桔梗藥材指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究2009版》，生成對(duì)照指紋圖譜，見圖2，計(jì)算各樣品指紋圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度，結(jié)果見表2。相似度計(jì)算結(jié)果顯示，13個(gè)桔梗藥材指紋圖譜相似度均大于0.9，表明本法對(duì)不同產(chǎn)地的桔梗藥材樣品的相似度較高。

圖1 13個(gè)桔梗藥材樣品指紋圖譜

圖2 對(duì)照指紋圖譜

表2 13個(gè)桔梗藥材指紋圖譜相似度

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)過程中曾經(jīng)選用Dionex C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱、Phenomenex C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱、Agilent C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱、WATERS C18(3.9mm×150mm,5μm)柱試驗(yàn)，結(jié)果表明Dionex C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱對(duì)桔梗藥材的分離效果最好。對(duì)不同品牌或同一品牌不同型號(hào)的儀器進(jìn)行了考察，如：Agilent 1200、Agilent 1100、Waters 2695HPLC，結(jié)果表明不同廠家的儀器獲得的色譜圖相似度良好，說明本方法能適用于不同的液相色譜儀。對(duì)流動(dòng)相中的酸性添加劑的品種進(jìn)行試驗(yàn)，分別測(cè)試了甲酸、乙酸、磷酸添加劑，結(jié)果添加磷酸后整體峰形和分離度等多個(gè)指標(biāo)得到優(yōu)化，故選擇磷酸作添加劑。再分別測(cè)定0.05%、0.1%、0.15%的磷酸水溶液為水相的色譜圖，通過比較發(fā)現(xiàn)0.1%磷酸水體系分離效果最佳。

3.2 用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)13個(gè)桔梗藥材樣品生成的對(duì)照指紋圖譜，并計(jì)算13個(gè)桔梗藥材的相似度，結(jié)果均大于0.9，表明該法可為桔梗藥材的質(zhì)量控制方法提供參考。

3.3 桔梗主要含有皂苷，其總皂苷的提取物可添加至煙絲中，可起到平衡水份的保潤(rùn)作用。