★ 韓飛 曾文雪 黃瀟* 姚雪蓮 趙志冬 羅曉健

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 江西 南昌 330006)

木香大安丸出自《痘疹世醫(yī)心法》卷十二，全方由木香、枳實、黃連、陳皮、山楂、砂仁等十一味中藥組成，具有消食導(dǎo)滯、祛熱健脾、緩消平補、不溫不燥等功效，用于治療小兒食滯，頭溫腹熱，噯氣惡食，煩不安眠等病癥臨床效果顯著。將其劑改成顆粒劑后，具有劑量準確、穩(wěn)定性強、更適合小兒服用等優(yōu)點。由于原方無質(zhì)量標準，為能有效控制其質(zhì)量，本文對方中主要藥味及有效成分分別進行定性、定量研究，可為制劑提供質(zhì)量控制標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1200高效液相色譜儀(VWD檢測器，Agilent-1200化學(xué)工作站)；BSZZ4S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,感量0.01mg)，Labomed UVS-2800紫外可見分光光度計(美國奧然科技有限公司)，超聲儀(KQ5200DA型昆山市超聲儀器有限公司)，紫外熒光燈(Q/3202 2LDJA02無錫科達儀器廠)，真空干燥箱(DGF-6020型上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110721-200211)；辛弗林對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110727-200306)；去氫木香內(nèi)酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111525-200706)；硅膠G板(青島海洋化工分廠)；乙腈、甲醇為色譜純(天津市永大化學(xué)試劑廠)，冰醋酸、無水乙醇為分析純(天津市博迪化工有限公司)，水為超純水，其余均為分析純(天津市永大化學(xué)試劑廠)，木香大安顆粒自制，木香、陳皮、枳實等對照藥材均為中國藥品生物制品鑒定所提供。

2 薄層鑒別

2.1 木香的鑒別

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取去氫木香內(nèi)酯對照品2.066mg，加三氯甲烷定容至10mL的容量瓶中，搖勻，即得0.2066g/L對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取成品顆粒(批號：20100813)適量，研磨成細粉，稱取細粉3.0g，加甲醇50mL，索式提取6h，濾去殘雜，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷10mL使溶解，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1mL作為供試品溶液。

2.1.3 對照藥材溶液的制備 取木香對照藥材1.0g，加甲醇50mL，回流提取2h，放冷，濾過，濾液濃縮至5mL，濾過，濾液作為對照藥材溶液。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 按處方中藥物比例，制成缺木香的陰性顆粒，按2.1.2項下制成陰性對照品溶液。

薄層層析：照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述四種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-環(huán)己烷(5∶1)為展開劑，展開10cm，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點，陰性對照品無此斑點，見圖1。

圖1 木香薄層鑒別圖譜

2.2 枳實的鑒別

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取辛弗林對照品2.364mg，加甲醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，即得0.2364g/L對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取成品顆粒(批號：20100813)適量，研磨成細粉，精密稱取細粉3.0g，加甲醇50mL，超聲處理2次，每次30min，濾去殘雜，濾液蒸干，殘渣加甲醇5mL使溶解，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1mL作為供試品溶液。

2.2.3 對照藥材溶液的制備 另取枳實對照藥材1.0g，加甲醇50mL，超聲提取40min，放冷，濾過，甲醇補足失重，取續(xù)濾液1mL作為對照藥材溶液。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 按處方中藥物比例，制成缺陳皮和枳實的陰性顆粒，按2.2.2項下制成陰性對照品溶液。

圖2 枳實薄層鑒別圖譜

薄層層析：按照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述四種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-氨水(3∶1∶1)的溶液為展開劑，飽和1h，展開12cm，取出，晾干，噴以0.5%茚三酮乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照品無此斑點，見圖2。

2.3 陳皮的鑒別

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品4.117mg，加甲醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，即得0.4117g/L對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取成品顆粒(批號：20100813)適量，研磨成細粉，稱取細粉3.0g，加甲醇50mL，回流提取3h，濾過，濾液蒸干，殘渣用水20mL溶解，離心，取上清液上聚酰胺柱，分別用水40mL，30%乙醇40mL洗脫，洗脫液蒸干，殘渣加5mL甲醇溶解，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1mL作為供試品溶液。

2.3.3 對照藥材溶液的制備 另取陳皮對照藥材1.0g，加甲醇50mL，回流提取3h，放冷，濾過，濾液濃縮至10mL，濾過，取續(xù)濾液1mL作為對照藥材溶液。

2.3.4 陰性對照品溶液的制備 按處方中藥物比例，制成缺取陳皮和枳實的陰性顆粒，按2.3.2項下制成陰性對照品溶液。

薄層層析：按照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)，吸取上述四種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)為展開劑展開約3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開劑，展至約12cm，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁試液，置紫外燈(365nm)下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光斑點，陰性對照品無此斑點，見圖3。

圖3 陳皮薄層鑒別圖譜

3 含量測定

3.1 橙皮苷的含量測定

3.1.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil 0DS2 C18(5μm，250mm×4.6mm，大連依利特公司)；流動相：乙腈-6.0%醋酸溶液(79∶21)；流速：1.0mL/min；檢測波長：283nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL，理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應(yīng)不低于5000。

3.1.2 溶液的制備 (1)對照品溶液的制備 稱取橙皮苷對照品約9mg,置10mL容量瓶中,加甲醇適量使溶解,并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1mL置5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，定容即得(每1mL含橙皮苷0.1823mg)。

(2)供試品溶液的制備 取同一批成品顆粒(批號:20100911)適量，研細，精密稱取1.0g粉末，置100mL容量瓶中，精密加入甲醇定容，密塞，精密稱定重量，超聲處理(200W，40KHz)3次，每次20min，放冷，用甲醇補足失重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

(3)陰性對照溶液的制備 按供試品的處方比例和制備工藝，制成陰性對照顆粒。取本品1.0g，按3.1.2中(2)項下方法制成陰性對照溶液，即得。

3.1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，分別進樣20μL，記錄色譜圖。結(jié)果在上述色譜條件下，理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應(yīng)不低于4000，與相鄰峰分離度大于2，主峰保留時間9.86min。陰性對照品色譜圖中,在與對照品色譜圖相對應(yīng)的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)。表明制劑中其他成分對橙皮苷的測定無干擾。

3.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取橙皮苷對照品溶液(0.1823mg/mL)0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，定容，分別精密吸取溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以橙皮苷對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為:Y=2016.2X-24.147相關(guān)系數(shù):R=0.9999，結(jié)果表明，橙皮苷對照品在0.0363～2.3219μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.5 精密度試驗 精密吸取橙皮苷對照品溶液(0.1823mg/mL)及供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，依法測定，記錄峰面積，得相對標準偏差(RSD)分別0.78%，1.25%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.1.6 重復(fù)性試驗 按3.1.2中(2)項下方法制備供試品溶液，對同一批樣品(批號20100911)6份進行測定，橙皮苷平均含3.0568mg/g，RSD為0.514%(n=6)，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

3.1.7 穩(wěn)定性試驗 取成品顆粒(批號20100911)適量，研細，精密稱取粉末1.0g，按3.1.2中(2)項下制備成供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液各20μL，分別于制備后0，2，4，8，12，24h，依法測定，峰面積的RSD為0.673%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.8 加樣回收率試驗 稱取同一批號的樣品(批號20100911，含量為3.0568mg/g)0.5g，共9份，分成3組，每組3份，精密稱定后，第1組每份加入樣品含量80%的橙皮苷對照品，第2組每份加入樣品含量100%的橙皮苷對照品，第3組每份加入樣品含量120%的橙皮苷對照品，按3.1.2中(2)項下制備成樣品溶液，依法測定，平均含量為結(jié)果見表1。

表1 橙皮苷加樣回收率試驗(n=6)

3.1.9 樣品含量測定 取三批(20100906、20100925、20101018)樣品，按3.1.2中(2)項項下方法制備成供試品溶液，進行測定，根據(jù)峰面積計算橙皮苷的含量3.0706mg/g，結(jié)果見表2。

表2 3批樣品中橙皮苷含量測定結(jié)果/mg·g-1

4 討論

4.1 提取方法和展開系統(tǒng)的選擇

本文對制劑中主要成分進行TLC鑒別時，在《中國藥典》[1]及參考相關(guān)文獻[2-4]的基礎(chǔ)上嘗試了多種提取方法和展開系統(tǒng)，取得不錯的效果。

4.1.1 在枳實薄層鑒別中，藥典上規(guī)定正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)為展開劑，而經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)以正丁醇-冰醋酸-氨水(3∶1∶1)為展開劑效果更好，不僅斑點清晰，分離度好，且展開時間大大縮短。

4.1.2 在陳皮的薄層鑒別中，嘗試了乙酸乙酯-甲醇-水(65∶35∶10)、氯仿-甲醇-丁酮-丙酮(8∶2∶1∶1)、乙酸乙酯-甲苯(65∶35)等多種展開劑，最終以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)展開約3cm，取出晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)展開至12cm，效果最好。

4.2 流動相的選擇

本實驗在進行橙皮苷含測時，曾嘗試過甲醇-水(35∶65)，甲醇-1%磷酸水溶液(40∶60)，乙腈-3%醋酸水溶液(25∶75)等流動相，效果均不如本文所采用流動相乙腈-6.0%醋酸溶液(79∶21)，在該色譜條件下，橙皮苷與其它組分峰能達到基線分離，理論塔板數(shù)大于4000。

本文通過對成品顆粒的質(zhì)量研究，建立了制劑中木香、枳實、黃連、陳皮等四味藥材的定性鑒別方法，該法重現(xiàn)性好，專屬性強，色譜斑點清晰，分離度好；采用HPLC法對指標成分橙皮苷進行含量測定，并進行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明含測方法分離度好，重現(xiàn)性強，回收率高，可用于木香大安顆粒的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會.中國藥典.一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:758．

[2]利毛才讓，熱增才旦.藏藥四味藏木香湯散的質(zhì)量研究[J].中成藥，2010，32(3)：524-526.

[3]項海芝，桑育黎，郝延軍,等.小兒肺咳顆粒中陳皮的薄層鑒別方法改進研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25(3)：462-463.

[4]王振江，呂潔，丁芳,等.《中國藥典》2005年版枳實辛弗林含量及薄層鑒別的探討[J].中國藥品標準，2010，11(2)：148-149.