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EGCG對5-氟尿嘧啶用于食管癌CaEs-17細胞增加療效的實驗研究

2014-08-28 12:42:06張潤華王賢和陳萍鄧守恒蔡曉軍
河北醫(yī)藥 2014年21期
關(guān)鍵詞:抑制率細胞周期培養(yǎng)液

張潤華 王賢和 陳萍 鄧守恒 蔡曉軍

·論著·

EGCG對5-氟尿嘧啶用于食管癌CaEs-17細胞增加療效的實驗研究

張潤華 王賢和 陳萍 鄧守恒 蔡曉軍

目的觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)體外增強5-氟尿嘧啶(5-Fu)對食管癌CaEs-17細胞化療敏感性的作用,并探討可能的作用機制。方法實驗分為空白對照組、5-Fu組(培養(yǎng)液中5-Fu終濃度為6 μmol/L),EGCG組(培養(yǎng)液中EGCG終濃度為20 mg/L)、聯(lián)合組(培養(yǎng)液中EGCG終濃度為20 mg/L,5-Fu濃度為6 μmol/L),4組作用24 h,CCK-8法和細胞克隆形成法檢測細胞增殖抑制率和存活率,金氏公式評價二藥的協(xié)同效果;流式細胞儀檢測細胞凋亡率及周期分布;Transwell法檢測細胞侵襲力;免疫印跡法檢測突變型P53(mtP53)蛋白表達水平。結(jié)果EGCG、5-Fu均可抑制CaEs-17細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、降低細胞存活率和侵襲力;EGCG、5-Fu均可阻滯細胞于G0/G1期,并能下調(diào)mtP53蛋白表達水平(P<0.05),二藥聯(lián)用上述作用效果更為顯著(P<0.01)。結(jié)論EGCG能夠增強5-Fu對食管癌CaEs-17細胞的化療敏感性,這種作用部分是通過下調(diào)mtP53蛋白實現(xiàn)的。

食管癌;表沒食子兒茶素沒食子酸酯;5-氟尿嘧啶;化療

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)是第一個人工合成的抗腫瘤代謝藥物,其作為嘧啶類的氟化物,在體內(nèi)可通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性,阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷核,干擾腫瘤細胞DNA合成起到殺滅腫瘤的作用,其具有較廣的抗瘤譜,是臨床上包括食管癌在內(nèi)的消化道腫瘤道選的化療藥物之一,然而,骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)及血液毒性等不良反應(yīng)限制了其最大療效的發(fā)揮。如何在不增加甚至減少5-Fu用量的基礎(chǔ)上提高其化療療效是腫瘤藥物研究領(lǐng)域的熱點。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)[1,2]是綠茶中含量最高,活性最強的單體,其在體外亦具有廣譜的抗腫瘤作用。研究還發(fā)現(xiàn)EGCG與紫杉醇聯(lián)用尚具有增加肺癌細胞對紫杉醇敏感性的作用[3],EGCG與5-Fu聯(lián)用抗腫瘤作用如何筆者未見報道,本文對其在體外聯(lián)用抗食管癌作用進行研究,報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、甲基纖維素(CPS4000)、碘化丙錠(PI)為美國Sigma產(chǎn)品;5-Fu江蘇南通精華藥業(yè)產(chǎn)品;CCK-8試劑盒購自日本同仁公司;Transwell小室購自美國Costar公司;兔抗人突變型P53(mtP53)單抗及山羊抗兔的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為進口分裝分析純;Mini-Prote電泳儀(美國伯樂公司);圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司);Mod 550型全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司);Epics Elite ESP型流式細胞儀(美國Coulter公司)。

1.2 細胞及培養(yǎng) 食管癌細胞株CaEs-17購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所,培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi),于37℃、飽和濕度,5%CO2條件下培養(yǎng),每2~3天用0.25%胰酶消化,1∶2傳代。

1.3 CCK-8法檢測單獨及聯(lián)合給藥對細胞增殖的影響 取指數(shù)生長期CaEs-17細胞,以1×105個/孔接種于96孔板,37℃、飽和濕度,5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后吸出原培養(yǎng)液,分為EGCG組(培養(yǎng)液中EGCG終濃度為20 mg/L)、5-Fu組(培養(yǎng)液中5-Fu終濃度為6 μmol/L)、聯(lián)合組(培養(yǎng)液中EGCG終濃度為20 mg/L,5-Fu終濃度為6 μmol/L),另設(shè)空白對照組(只加入RPMI1640培養(yǎng)基,未給予其他任何處理),EGCG和5-Fu各取1/2 IC50值,EGCG IC50值參照預(yù)實驗結(jié)果,5-Fu IC50值參照文獻[4],繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,吸去上清液,每孔加入10 μl CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)1 h,酶標儀檢測各孔在450 nm波長下的吸光度(OD)值,代入公式計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD度)/對照組OD值×100%。

1.4 克隆形成法檢測細胞增殖[5]細胞分組及處理同1.3,參照文獻配制半固體培養(yǎng)基,收集經(jīng)EGCG、5-Fu單獨和聯(lián)合作用24 h的各組細胞,PBS洗去藥物,離心1 000 r/m×3 min,用含20%小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成7.0×103個/ml單細胞懸液,于24孔板預(yù)加1.2%甲基纖維素培養(yǎng)基1.0 ml/孔,加入單細胞懸液50 μl,使每孔細胞數(shù)為350個,每個濃度設(shè)4個復(fù)孔,混勻后置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12~14 d后于倒置顯微鏡下計數(shù)細胞克隆數(shù),計算細胞存活率(給藥組平均克隆數(shù)/未給藥組平均克隆數(shù)×100%),實驗重復(fù)3次。

1.5 流式法檢測細胞周期及凋亡 細胞分組及處理同1.3,收集各組作用24 h細胞,0.01 mol/L PBS 0.5 ml重懸細胞,加70%乙醇1 ml,-20℃固定24 h,加入PI (終濃度為50 μl/ml)和RNA酶(終濃度為0.25 mg/ml),室溫下避光孵育30 min后流式細胞儀作DNA分析,以ModFit LT軟件分析,擬合計算各時相細胞的百分比。

1.6 Transwell法檢測細胞侵襲性改變 細胞分組及處理同1.3,以NIH3T3細胞培養(yǎng)液做趨化液,在Transwell上室內(nèi)加入100 μl不含小牛血清的RPMI1640,37℃孵育1 h,加入上述各組細胞懸液20 μl(調(diào)細胞濃度為1.0×105個/ml),每組4個復(fù)孔。37℃ 12 h后取出濾膜,甲醇固定,HE染色。顯微鏡下計數(shù)濾膜外表面的細胞數(shù),每張濾膜隨機取5個視野(×200)取均值,實驗重復(fù)3次,以相對侵襲抑制率表示腫瘤細胞的侵襲力,相對侵襲抑制率(%)=(對照組-實驗組)/對照組×100%。

1.7 免疫印跡法檢測mtP53蛋白表達 細胞分組及處理同1.3,收集細胞,PBS洗2次,裂解,離心,收集上清,即為細胞總蛋白,進行蛋白定量,調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度,加等量蛋白于上樣緩沖液,煮沸,在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜,依次加入mtP53蛋白一抗和二抗,顯色,拍照。Quanti Scan軟件進行蛋白條帶掃描分析。

1.8 協(xié)同作用評價 以金氏公式[6]q=E(a+b)/[( Ea+Eb)-Ea×Eb]評價藥物合用是否有協(xié)同作用:E(a+b)為合用抑制率,Ea和Eb分別為A藥和B藥的抑制率。分子為實測合并效應(yīng),分母為期望合并效應(yīng),q 在0.85~1.15為單獨相加(+),q在1.15~2.0為增強(++),q在2.0為明顯增強(+++),q在0.85~0.55為拮抗(-),q <0.55為明顯拮抗(-)。

2 結(jié)果

2.1 單獨和聯(lián)合給藥對細胞增殖的抑制作用 6 μmol/L 5-Fu和20 mg/L EGCG作用食管癌細胞24 h對細胞增殖產(chǎn)生的抑制率分別為46.4%和37.5%,二藥合用,則抑制率升高至81.7%,合用產(chǎn)生的抑制率大于兩藥單獨應(yīng)用,q值為1.23,表明兩藥合用產(chǎn)生的抑制效果遠大于兩藥單獨相加,產(chǎn)生協(xié)同增強效應(yīng)。見表1。

2.2 單獨和聯(lián)合給藥對細胞周期分布、凋亡的影響 6 μmol/L 5-Fu單獨作用食管癌細胞24 h,G0/G1期細胞數(shù)目由43.8%升高至69.7%(P<0.01),而S期細胞數(shù)目則由45.6%下降至21.3% (P<0.05),細胞周期被阻滯于G0/G1期。20 mg/L EGCG單獨作用24 h可使食管癌G0/G1期細胞數(shù)目由43.8%明顯上升至55.3% (P<0.05),細胞周期亦被阻滯于G0/G1期。二藥聯(lián)用 G0/G1期阻滯現(xiàn)象更為顯著,G0/G1期細胞數(shù)目由43.8%增高87.3%,S期細胞數(shù)目由45.6%減少至9.6%,G2/M期細胞數(shù)目則由11.7%下降至3.2%(P<0.01)。二藥均可誘導(dǎo)細胞凋亡,聯(lián)用效果更為顯著(P<0.01)。見表2。

EGCG(mg/L)5?Fu(μmol/L)抑制率(%)q值協(xié)同等級00020037.5±2.20646.4±1.920681.7±2.51.23++

表2 EGCG與5-Fu單獨和合用對CaEs-17細胞

注:與空白對照組比較,*P<0.05,#P<0.01

2.3 單獨和聯(lián)合給藥對細胞侵襲力和存活率的影響6 μmol/L、5-Fu、20 mg/L EGCG單獨作用食管癌細胞24 h均可明顯抑制細胞克隆形成,降低細胞存活(P<0.05),二藥合用效果更為顯著(P<0.01)。細胞侵襲實驗也顯示出相似的作用結(jié)果,表現(xiàn)為與空白對照組比較,經(jīng)5-Fu、EGCG單獨或聯(lián)合作用后的食管癌細胞穿過基底膜的能力大大降低,二藥合用后效果更為顯著(P<0.05或<0.01)。見表3。

組別存活率(%)侵襲細胞(個)抑制率(%)空白對照組-229±23-5?Fu組44.3±2.2?139±26?39.3±2.2?EGCG組54.2±2.8?183±18?20.1±1.6?5?Fu+EGCG組31.6±1.7#108±20#52.8±2.7#

注:與空白對照組比較,*P<0.05,#P<0.01

2.4 單獨和聯(lián)合給藥對細胞mtP53蛋白表達的影響 免疫印跡及灰度掃描定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),未經(jīng)處理的空白對照食管癌細胞中存在著mtP53蛋白的高表達,灰度值為(0.987±0.013), 經(jīng)5-Fu、EGCG單獨作用24 h,細胞內(nèi)mtP53蛋白灰度值分別降至(0.598±0.019)(P<0.05)和(0.385±0.012)(P<0.01)。而二藥聯(lián)合作用24 h,灰度值則降至(0.163±0.009)(P<0.01),下調(diào)作用更加顯著。見圖1。

3 討論

EGCG作為綠茶中的主要成分,具有顯著的清除氧自由基、抗氧化、抗衰老及抗腫瘤等功效[7-9]。目前有關(guān)EGCG的抗腫瘤研究多集中在誘導(dǎo)細胞凋亡,阻滯細胞周期,抑制腫瘤血管生成等方面,而對EGCG的放化療增敏及降低放化療毒性等方面的研究卻較少。本文中,筆者聯(lián)用1/2IC50值的EGCG和5-Fu作用于體外培養(yǎng)的食管癌細胞株CaEs-17,采用CCK-8法和克隆形成法檢測其對細胞增殖的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGCG、5-Fu均可明顯抑制細胞增殖,降低其存活,合用效果更顯著,證實EGCG確實具有增強5-Fu化療敏感性的作用。由于克隆形成實驗檢測的是單個細胞的增殖能力,故本部分實驗結(jié)果提示,在5-Fu化療中聯(lián)用EGCG不僅可對處于增殖期的細胞產(chǎn)生殺傷作用,還可明顯抑制腫瘤干細胞的增殖,這比單純抑制或者殺死癌細胞本身具有更大的價值[10]。

圖1 EGCG與5-Fu單獨和合用對食管癌細胞mtP53蛋白表達的影響(1,2,3,4分別為空白對照組、5-Fu組、EGCG組、EGCG+5-Fu組)

腫瘤發(fā)生不僅與細胞增殖失控有關(guān),還與細胞凋亡有關(guān)。筆者采用流式細胞法檢測了經(jīng)EGCG、5-Fu單獨和聯(lián)合作用后的細胞凋亡率,結(jié)果顯示,二藥單獨或聯(lián)用均可明顯誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)凋亡,聯(lián)用效果更為顯著。對細胞周期進行分析也顯示出相似的結(jié)果,EGCG、5-Fu無論單獨還是合用均可增加G0/G1期細胞比例,降低S期細胞比例,阻滯細胞周期于G0/G1期,合用阻滯效果更為顯著。由于細胞增殖的速度主要取決于細胞周期的長短,而細胞周期的長短又主要取決于G1期,G0/G1期阻滯可使細胞增殖周期延長,從而誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)凋亡[11]。

侵襲是惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因之一。筆者采用Transwell法檢測結(jié)果顯示,5-Fu、EGCG亦可對食管癌細胞的侵襲能力產(chǎn)生明顯的抑制作用,二藥合用,抑制效果更加顯著。提示5-Fu聯(lián)合EGCG尚能起到抑制5-Fu單藥化療后食管癌易出現(xiàn)的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等作用。

P53是一種常見的抑癌基因,主要起到“分子警察”的作用,在保持正常細胞基因組完整性上發(fā)揮作用。正常組織野生型P53蛋白表達量很少,且半衰期很短,很難檢測到。突變型P53(mtP53)系由野生型P53突變而來,其表達的蛋白可使細胞增殖失控、凋亡受阻,最終使細胞發(fā)生癌變[12]。本實驗中,未經(jīng)處理的食管癌細胞中存在著mtP53蛋白的高表達,而經(jīng)5-Fu、EGCG單獨和聯(lián)合作用后該蛋白表達明顯受到抑制,合用抑制效果更為明顯,表明上述EGCG、5-Fu兩種藥物單獨和合用對食管癌細胞產(chǎn)生的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和阻止侵襲等藥理作用至少部分是與其能下調(diào)mtP53蛋白表達有關(guān),但具體的分子機制尚需進行深入研究。

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5 韓銳主編.抗癌藥物研究與實驗技術(shù).第1版.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1996.284-290.

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EffectofEGCG’sinenhancingchemotherapysensitivityof5-fluorouracilonhumanesophagealcancerlineCaEs-17invitro

ZHANGRunhua,WANGXianhe,CHENPing,etal.

OncologyCenter,People’sHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalCollage,Hubei,Shiyan442000,China

ObjectiveTo observe the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) in enhancing chemotherapy sensitivity of 5-fluorouracil (5-Fu) on human esophageal cancer line-CaEs-17 in vitro,and to explore possible action mechanism.MethodsThe experiment consisted of four groups:blank control group,5-Fu group (final concentration of 5-Fu:6μmol/L in culture medium),EGCG group (final concentration of EGCG:20mg/L),combination group (final concentration of EGCG:20mg/L and 5-Fu:6μmol/L),affected for 24 hours in four groups.The inhibitory rate on cell proliferation and survival rate were detected by CCK-8 method and cell clone formation test,respevtively;the synergism effect of two drugs was evaluated according to Jin’s formula;the cell apoptosis rate and cell cycle distribution were detected by flow cytometry;cell invasiveness was determined by Transwell method;the expression levels of mutant P53 (mtP53) protein were detected by Western Blot.ResultsBoth EGCG and 5-Fu could inhibit the proliferation of CaEs-17 cells,induce cell apoptosis,decrease cell survival rate and cell invasiveness,moreover,both EGCG and 5-Fu could block cell at G0/G1 stage and cloud down-regulate the expression levels of mtP53 protein (P<0.05),the effects of combined application of two drugs were more obvious (P<0.01).ConclusionEGCG can enhance chemotherapy sensitivity of 5-Fu on human esophageal cancer line-CaEs-17 in vitro,which is performed partly through down-regulating the expression levels of mutation P53 protein.

esophageal cancer;epigallocatechin-3-gallate;5-fluorouracil;chemotherapy

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.002

項目來源:湖北省自然科學(xué)基金資助項目(編號:2008CDZ022)

442000 湖北省十堰市,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心

蔡曉軍,442000 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院;

E-mail:1220658176@qq.com

R 735.1

A

1002-7386(2014)21-3208-04

2014-05-09)

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