趙春清 劉志 閆威 張濤 張彬 李威 劉松 婁紅

·論著·

VEGF、MVD、Ki-67聯(lián)合檢測與大腸癌臨床病理特征及預后相關(guān)性的研究

趙春清 劉志 閆威 張濤 張彬 李威 劉松 婁紅

目的探討血管內(nèi)皮生長因子(vascular endo-thelial growth factor， VEGF)、微血管密度(microvessel density， MVD)和細胞增殖核抗原(Ki-67)在大腸癌組織中的表達及預后意義。方法采用免疫組織化學檢測64例大腸癌組織中VEGF、MVD和Ki-67的表達情況，并分析其與大腸癌臨床病理特點和預后的關(guān)系。結(jié)果免疫組織化學檢測顯示VEGF、MVD、Ki-67表達在不同Dukes分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移中存在明顯差異(P<0.05)，不同分化程度之間MVD表達存在差異(P<0.05)，而三者的表達與性別、年齡、部位、大小無關(guān)(P>0.05)，VEGF、Ki-67表達與MVD呈正相關(guān)，且VEGF、MVD表達與預后相關(guān)。結(jié)論VEGF、MVD、Ki-67表達與Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度相關(guān)，VEGF、MVD與預后相關(guān)，可作為檢測大腸癌預后的參考指標。

大腸癌;VEGF;MVD;Ki67;免疫組織化學

大腸癌(colorectal cancer，CRC)為結(jié)腸癌和直腸癌的總稱，是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，僅次于胃癌、食管癌，是世界第三大惡性腫瘤，在西方國家中居惡性腫瘤死因的第2位[1]。由于生活方式、生存環(huán)境及飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國大腸癌的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢[2]，而大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后因素尚不清楚，血管內(nèi)皮生長因子 VEGF 被認為是最重要的血管形成因子[3]，血管的生成在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，微血管密度(MVD)是反映腫瘤組織內(nèi)血管生成狀況的一個重要參數(shù)，Ki-67 是一種反映細胞分裂和增殖活性的標志物，Ki-67 在腫瘤組織中表達高低，與腫瘤的增殖密切相關(guān)[4]，本研究通過免疫組織化學檢測VEGF、MVD和Ki-67的表達，分析與臨床病理特點及預后的關(guān)系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2005年1月1日至2007年12月31日我院收治并經(jīng)病理證實的大腸癌患者64例，癌旁正常組織20例(距癌灶>5 cm)，所有患者術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療，術(shù)后標本均經(jīng)病理證實，術(shù)后隨訪5年(隨訪資料完整)，男35例，女29例；年齡30～82歲，中位年齡55歲。腫瘤部位：直腸24例，結(jié)腸40例(乙狀結(jié)腸20例、升結(jié)腸8例、降結(jié)腸10例、橫結(jié)腸2例)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性 25例，陰性39例；高中分化49例，低分化15例；腫瘤直徑≥5 cm 34例，<5 cm 30例；Dukes分期：A+B期26例，C+D期38例。

1.2 試劑 一抗兔抗人 VEGF 單克隆抗體，一抗鼠抗人 Ki67 單克隆抗體，鼠抗人 CD34單克隆抗體，即用型S-P免疫組化染色試劑盒均為 Santa cruz公司產(chǎn)品 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，用已知陽性標本作為陽性對照,以 PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 方法 所有標本均經(jīng) 10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)制成 4 μm 厚切片若干張，進行SP 法免疫組化染色，實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 免疫結(jié)果的判定 VEGF計數(shù)：VEGF蛋白主要定位于癌細胞的細胞漿中,呈棕黃色/棕褐色,參照 Saito 等[5]綜合計分法由陽性著色細胞所占百分數(shù)與細胞著色強度二者結(jié)合起來判斷。陽性著色細胞<5%計0分;5%～25%計1分;26%～50%計2分;51%～75%計3分;>75%計4分。細胞著色強度:不著色計0分;淡黃色計1分;棕黃色計2分;棕褐色計3分。二者積分相加0～2分為陰性,>3分為陽性。MVD計數(shù)方法：CD34單克隆抗體能與血管內(nèi)皮細胞上的CD34蛋白相結(jié)合,定位于血管內(nèi)皮,呈棕褐色。參照Weidner等[6]評判標準計算,先在低倍視野內(nèi)(40、100×)找到腫瘤組織內(nèi)微血管密度最高的區(qū)域(hot spot),然后在高倍視野內(nèi)(200×)通過計算機圖像分析系統(tǒng)在監(jiān)視器上計數(shù)微血管的數(shù)目,凡呈現(xiàn)棕色單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇者均作為 1 個血管計數(shù)單位,管腔面積大于8個紅細胞直徑的血管不計數(shù)，每張切片在200倍視野下計數(shù)5個視野,取平均值。Ki67主要表達于細胞核，每張切片觀察5個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，陽性細胞所占比例≥10%為陽性(+)，<10%為陰性[7]。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、Ki-67表達及MVD計數(shù) VEGF表達主要定位于胞漿，呈黃色或棕黃色顆粒狀分布。VEGF在大腸癌組織的陽性表達率87.50%(56/64)，在癌旁正常組織陽性表達率5%(1/20)，兩者之間存在顯著差異(P<0.05)，Ki-67的表達主要定位于細胞核，呈棕黃色顆粒。Ki-67在大腸癌組織的陽性表達率89.06%(57/64)，在癌旁正常組織的表達率10%(2/20)，存在顯著差異(P<0.05)，大腸癌組織中的MVD計數(shù)(25.13±5.43)明顯高于癌旁組織(13.31±4.21)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 VEGF在大腸癌組織中的表達(SP×200)

圖2 Ki?67在大腸癌組織中的表達(SP×400)

2.2 VEGF、MVD、Ki-67與臨床病理特點的相關(guān)性 VEGF、Ki-67表達及MVD計數(shù)與臨床病理特征的相關(guān)性，免疫組織化學檢測顯示，VEGF、Ki-67、MVD表達與Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且隨著Dukes分期的增高表達增強(C+D期明顯高于A+B期)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無轉(zhuǎn)移組，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),MVD計數(shù)在低分化組明顯高于高中分化組，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),三者的表達在性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 VEGF、Ki-67陽性組，陰性組表達與MVD比較 VEGF、Ki-67、MVD三者之間的相關(guān)性，本研究64例大腸癌組織中的MVD計數(shù)均值為(25.13±5.43)，VEGF陽性組MVD計數(shù)顯著高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),ki-67陽性組MVD計數(shù)明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),VEGF、Ki-67表達經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，VEGF、Ki-67的表達與MVD呈正相關(guān)。見表2、3。

表1 VEGF、MVD、Ki-67與臨床病理特點的相關(guān)性

2.4 VEGF、Ki-67、MVD表達與大腸癌的預后 本組研究中64例大腸癌患者3年生存率84.38%(54/64),5年生存率64.06(41/64)，VEGF表達陽性組(生存率62.5%)與陰性組(生存率75%)5年生存率經(jīng)Log- Rank 法檢驗差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，而Ki-67陽性組(生存率64.91%)與陰性組(生存率57.14%)5年生存率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.190)。大于MVD均值組(生存率50%)與小于均值(生存率78.13%)比較，5年生存率差異也有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。見圖3～5。

表2 VEGF、Ki-67陽性組、陰性組表達與MVD比較

表3 VEGF、Ki-67與MVD的相關(guān)性 例

圖3 生存時間(月)

圖4 生存時間(月)

圖5 生存時間(月)

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預后是一個多因素，多步驟的復雜過程，而在這一過程中腫瘤血管的形成及細胞增殖起著至關(guān)重要的作用。目前對于VEGF在腫瘤中的作用及表達主要停留在體外實驗階段，部分研究發(fā)現(xiàn)在腎癌，乳腺癌，黑素瘤，肝癌，胃癌，膀胱癌，子宮內(nèi)膜癌，大腸癌及胚胎組織性腫瘤中多有表達，并明顯高于非腫瘤組織[8]，Ki-67是一種存在于增殖細胞核的與細胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，是目前公認的檢測細胞增殖活性較為準確、可靠、理想的抗原[9]，而增殖活性高的腫瘤具有更高的侵襲性，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF、Ki67、MVD的表達明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與文獻報道相符，提示三者的表達與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。

目前研究認為腫瘤的血管生成在其生長 浸潤和轉(zhuǎn)移中起著重要作用 并影響腫瘤的生物學行為和預后，腫瘤血管生成的定量評估包括 MVD 和VEGF[10]。有學者研究發(fā)現(xiàn)VEGF可以通過促進大腸癌中血管的生成而促進癌的不斷生長、浸潤甚至轉(zhuǎn)移，其表達程度的高低與大腸癌的生物學行為密切相關(guān)，它的過表達可能是結(jié)腸癌預后的不良因子，而血管的大量滋生，必然促進細胞過度增殖，同時細胞的增殖也需要大量新生血管提供必要營養(yǎng)支持，二者之間關(guān)系密切。另有學者研究發(fā)現(xiàn)實體腫瘤直徑超過1～2 mm，如果沒有新生血管的形成，腫瘤將停止生長[11]，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF、Ki67、MVD的表達在Dukes分期C、D期組和淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組明顯高于A、B期組及淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組，表達存在明顯差異(P<0.05)，MVD在大腸癌低分化組表達明顯高于高中分化組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且VEGF、Ki67的表達與MVD呈正相關(guān)性，由此我們認為大腸癌的惡化及轉(zhuǎn)移與三者高表達相關(guān)，推測三者可能具有正協(xié)同作用，在臨床上，VEGF、Ki-67、MVD異常高表達可作為判斷大腸癌侵襲性的一個重要分子生物學指標，同時檢測到手術(shù)標本中VEGF、Ki-67、MVD高表達情況，可對大腸癌惡性程度的早期評估提供依據(jù)。

本研究經(jīng)隨訪發(fā)現(xiàn)，VEGF陽性組及MVD高表達組(大于均值組)5年生存率與VEGF陰性組及MVD低表達組存在顯著差異(P<0.05)，提示VEGF與MVD與大腸癌的預后相關(guān)，而Ki-67陽性組與陰性組之間5年生存率接近，兩者之間無差異性(P>0.05)，表明Ki-67表達對大腸癌患者預后影響不大。

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StudyonthecorrelationbetweencombineddetectionofVEGF,MVD,Ki-67andclinicalpathologicalcharacteristicsofcolorectalcarcinomaaswellaspatient’sprognosis

ZHAOChunqing,LIUZhi,YANWei,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,TheSecondHospitalofBaodingCity,Hebei,Baoding071000,China

ObjectiveTo investigate the expression and the prognostic significance of vascular endothelial growth factor (VEGF),microvessel density (MVD) and Ki-67 in colorectal carcinoma.MethodsThe expression levels of VEGF,MVD and Ki-67 were detected by immunohistochemistry in 64 cases of colorectal carcinoma,and the correlation between their expressions and clinical pathological characteristics and prognosis of colorectal carcinoma was analyzed.ResultsThe results by immunohistochemical staining showed that there were significant differences in the expression levels of VEGF MVD and Ki-67 in different Dukes stages,with or without lymph node metastasis (P<0.05),there were significant differences in the expression levels of MVD in different differentiation degree (P<0.05).However the expressions of VEGF,MVD and Ki-67 were not related with patient’s age and sex,tumor’s size and position (P>0.05),moreover,the expression levels of VEGF and Ki-67 were positively correlated to those of MVD,and the expression of VEGF and MVD was correlated to patient’s prognosis.ConclusionThe expressions of VEGF,MVD,Ki-67 are related with Dukes staging,lymph node metastasis,tumor differentiation degree.The expression of VEGF and MVD is correlated to prognosis of patients with colorectal carcinoma,which can be regarded as reference parameters for evaluating patient’s prognosis.

colorectal carcinoma;VEGF;MVD;Ki67;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.008

071000 河北省保定市第二醫(yī)院普外科

劉志，071000 河北省保定市第二醫(yī)院普外科；

E-mail：lz192@foxmail.com

R 735.34

A

1002-7386(2014)21-3226-04

2014-04-12)